LAD Ligadura: Um Modelo murino de Infarto do Miocárdio

Summary

Este vídeo demonstra como usar um modelo rápido e confiável para o estudo de processos Pathobiological e fisiopatológicas da isquemia miocárdica.

Abstract

Modelos de pesquisa de infarto e isquemia miocárdica são essenciais para investigar os processos agudos e crônicos Pathobiological e fisiopatológicas da isquemia miocárdica e para desenvolver e otimizar o tratamento futuro.

Dois métodos diferentes de criar isquemia do miocárdio são realizadas em roedores de laboratório. O primeiro método é criar crio infarto, uma técnica rápida, mas impreciso, onde um crio-caneta é aplicado sobre a superfície do coração (1-3). Usando este método, o cientista não pode garantir que o crio cicatriz leva a isquemia, também uma lesão do miocárdio é vasta criado que mostra efeitos colaterais fisiopatológicos que não estão relacionados ao infarto do miocárdio. O segundo método é a ligadura permanente da artéria descendente anterior esquerda (DAE). Aqui, o LAD é ligada com um ponto único, formando uma isquemia, que pode ser visto quase que imediatamente. Fechando a LAD, há ainda fluxo de sangue é permitida naquela área, enquanto o tecido circundante do miocárdio não é quase afetados. Este procedimento cirúrgico imita os aspectos Pathobiological e fisiopatológicas que ocorrem na isquemia-infarto do miocárdio relacionados.

O método introduzido neste vídeo demonstra o procedimento cirúrgico de um modelo de infarto do rato por ligadura do LAD. Este modelo é conveniente para estudos Pathobiological e fisiopatológicos, bem como imunobiológicos em infarto cardíaco. A técnica mostrada proporciona alta precisão e se correlaciona bem com cortes histológicos.

Protocol

Balb / C camundongos com peso mínimo de 20g em uma idade de 8 a 12 semanas são comprados de Charles River (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld).
Os ratos são alojados em condições convencionais, pellets rato alimentado padrão e água ad libitum. Anestesiar mouse com isoflurano (2%) utilizando uma câmara de indução.

1. Raspar a área do pescoço e do lado esquerdo da caixa torácica e desinfectar com álcool 80%.
2. Posicione o mouse sobre as suas costas e colocar uma máscara sobre seu nariz e boca para manter a anestesia.
3. Verificar os reflexos beliscar a cauda e patas traseiras para ter a certeza que o rato é suficiente anestesiado.
4. Sob visão microscópica realizar uma incisão mediana cervical separando o músculo, pele e tecido que cobre a traquéia.
5. Quando a traquéia é exposta cortar um pequeno furo no tecido entre dois anéis de cartucho abaixo da glote para inserir o tubo endotraqueal (Figura 1). Inserir o tubo endotraqueal segurando a parte cranial da traquéia usando micro forecepts cirúrgico. Verifique o movimento do tórax, para ter certeza de que ambos os pulmões são bem ventiladas.
6. A taxa de respiração (RR) deve ser aproximadamente 110 por minuto, com pressão inspiratória de 17 a 18 centímetros H ₂ O. Vire o mouse com cuidado, deitado sobre seu lado direito, de frente para o lado esquerdo. Realizar uma toracotomia leftsided entre as 3 ^ª e 4 ^ª costela, e dissecar o tecido muscular e com cuidado, usando um Cauter para prevenir hemorragias.
7. Abra o tórax com cuidado, uma vez que o tórax é aberto, encontrar o coração, sem tocar o pulmão com qualquer objeto cortante. Agora, remova a parte do saco pericárdico, que está cobrindo o coração.
8. A LAD está localizado entre a artéria pulmonar ea aurícula esquerda. Use uma sutura Prolene 8-0 (Ethicon, Norderstedt, Alemanha) para ligadura do LAD proximal com uma sutura simples (Figura 2).
9. Colocar um tubo no peito (cateter, 28G venal), entre a 4 ^ª ea 5 ^ª costela.
10. Feche a incisão torácica em camadas, usando 6-0 Prolene sutura (Ethicon, Norderstedt, Alemanha) para se adaptar as costelas e prolene 4-0 (Ethicon, Norderstedt, Alemanha) para fechar a pele.
11. Drenagem do tórax com a ajuda de uma seringa de 2ml com cuidado (Figura 3). Posicione o mouse sobre as suas costas. Agora pegue o tubo endotraqueal e adaptar os anéis da traquéia cartucho com um ponto único usando suturas 7-0 Prolene (Ethicon, Norderstedt, Alemanha).
12. Coloque a máscara sobre o mouse e fechar a pele usando suturas Prolene 4-0 (Ethicon, Norderstedt, Alemanha).

Validação

Existem diferentes possibilidades para confirmar o sucesso da LAD ligadura.

O teste de troponina pode ser realizada 6 a 18 horas após a cirurgia, usando apenas 150 l de sangue sem a necessidade de eutanásia do animal. O sangue é aplicado a um kit personalizado troponina teste (TROP T Sensitive, Roche, Mannheim) (Figura 4). Troponina é uma proteína reguladora nos filamentos de actina da célula muscular, existem diferentes isotipos nos três tipos de músculos. A cTnI e cTnT isotipos são encontrados no coração e são liberados em lesão tecidual. O teste padronizado para a troponina T (cTnT) é baseada em duas coração anticorpos monoclonais específicos, um armadilhas da troponina na amostra de sangue, o segundo é um marcador.

A área de infarto podem ser identificados macroscopicamente após 3 dias (Figura 5).

TTC (2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto) coloração viabilidade tecidual medidas utilizadas para avaliar o tamanho do infarto. Corante azul de Evans (1,5%, 1,0 mL) em tampão fosfato (PBS) é injetado na cavidade do ventrículo esquerdo para medir a área do miocárdio isquêmico. O rato é sacrificados eo coração é colhida e seccionados em fatias. As fatias de tecido são incubados em 1% de solução PBS TTC, pH 7,4 a 37 ° C por 20min. Tecidos são fixados em 10% PBS-formol tamponado durante a noite a 2-8 ° C. TTC é administrado ex vivo para corante azul de Evans-negativos áreas (Figura 6).

Para histologia o mouse tem que ser sacrificados eo coração tem de ser incorporado para processamento posterior. Depois de realizar cortes em parafina, as lâminas são coradas com H & E (hematoxilina e eosina) ou tricrômico de visualizar tecido fibrótico (Figura 7).

Figura 1: tubo traqueal.
1A: Exposed traquéia, após incisão cervical ventral.
1B: Traquéia é aberto dois anéis de cartilagem caudal à laringe.
1C: tubo traqueal é inserido na traquéia.

Figura 2: O coração é exposto através de uma toracotomia esquerda lados, o LAD é ligada.

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Figura 3: Depois que o tórax é fechado, um dreno pleura é executada. O mouse ainda está sob anestesia.

Figura 4: Duas linhas aparecem após alguns minutos, quando o teste de troponina é positivo.

Figura 5: Mostra o coração explantado.
5A: Aspecto macroscópico do coração com a área isquêmica com uma cor desbotada esbranquiçada.
5B: seção transversal do coração infartado, a área isquêmica mostra no canto superior direito.

Discussion

Em resumo, este vídeo visualiza o modelo LAD ligadura passo-a-passo e identifica LAD-ligadura em ratos com a mesma facilidade viável procedimentos cirúrgicos.