एक इन विट्रो में FluoroBlok ट्यूमर आक्रमण परख

Published: July 20, 2009 doi: 10.3791/1475

Jeff Partridge¹, Paula Flaherty¹

¹BD Biosciences, Discovery Labware

Summary

इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे को मापने के लिए सेल संस्कृति एक प्रतिदीप्ति आधारित पद्धति का उपयोग आवेषण के माध्यम से सेल आक्रमण.

Abstract

metastatic कोशिकाओं की पहचान उनके तहखाने झिल्ली के माध्यम से आक्रमण और शरीर के अन्य भागों की ओर पलायन करने की क्षमता है. कक्ष दोनों छिपाना proteases कि नीचे तहखाने झिल्ली तोड़ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विस्थापित क्रम में आक्रामक होने के लिए सक्षम होना चाहिए. बी.डी. BioCoat ट्यूमर आक्रमण प्रणाली की स्थिति है कि उनके आक्रामक संपत्ति के मूल्यांकन की अनुमति के साथ कोशिकाओं को प्रदान करता है

Protocol

डाक लेबलिंग और माप बी.डी. calcein का उपयोग फ्लोरोसेंट रंजक

कक्ष quantitation के लिए लेबल के बाद वे बी.डी. Matrigel मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण किया है और बी.डी. FluoroBlok झिल्ली के माध्यम से पारित कर रहे हैं. एक परिणाम के रूप में, केवल सेल आक्रमण के endpoint माप प्राप्त किया जा सकता है.

~ 80% संगम कोशिकाओं के विकास.
डालने प्रणाली तैयार और rehydrate.
1. -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से पैकेज निकालें और यह कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं.
2. पन्नी पैकेज खोलें और डालने के कुओं के इंटीरियर के लिए 500 μL गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मीडिया जोड़ने. थाली 2 घंटे के लिए 37 rehydrate करने की अनुमति दें ° सी, 5% सीओ _2.
  नोट: यह uncoated बी.डी. फाल्कन 24 multiwell सम्मिलित प्रणाली है कि एक सेल प्रवास नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा FluoroBlok rehydrate करने के लिए आवश्यक नहीं है.
3. पुनर्जलीकरण के बाद, ध्यान से कुओं से सम्मिलित झिल्ली पर बी.डी. Matrigel मैट्रिक्स की परत के बिना परेशान मध्यम हटाने. सिस्टम अब का उपयोग करने के लिए तैयार है.
सेल monolayers trypsinizing और सीरम मुक्त DMEM में 5 x 10 ⁴ कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं resuspending सेल निलंबन तैयार करें.
नोट: यदि आप एक अलग सेल प्रकार का उपयोग कर रहे हैं आप के लिए इष्टतम बोने घनत्व को निर्धारित करने की आवश्यकता है . एक झरझरा वृद्धि की सतह पर अपने सेल प्रकार के लिए इष्टतम बोने घनत्व को निर्धारित करने के लिए, बोने के घनत्व ^की एक सीमा (कोशिकाओं / 2 सेमी) का उपयोग करें कि कोष्ठक बोने nonporous सतहों पर इस्तेमाल किया घनत्व ( यानी बोतल, बर्तन, और प्लेट). उदाहरण के लिए, यदि आप 2.5 x 10 के बीच विभिन्न सेल सांद्रता में ⁵ / कोशिकाओं ² सेमी, बीज पर वर्तमान में बीज 5 x ⁴ 10 और 5 x 10 ⁵ कोशिकाओं / ² सेमी करने के लिए इष्टतम प्रारंभिक बोने घनत्व निर्धारण.
शिखर कक्षों सेल निलंबन के 500 μL (2.5 x ⁴ कोशिकाओं 10) जोड़ें.
बेसल कक्षों में से प्रत्येक के 750 μL chemoattractant (DMEM में 5% FBS) जोड़ें, उपयोग के लिए नमूना बंदरगाहों का उपयोग.
बी.डी. BioCoat ट्यूमर आक्रमण सिस्टम और uncoated बी.डी. फाल्कन 24 multiwell 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ ₂ माहौल में 20-22 घंटे के लिए सम्मिलित प्लेट FluoroBlok सेते हैं.
ऊष्मायन के बाद, ध्यान शिखर कक्षों से मध्यम हटायें. यह बर्बादी कंटेनर में सामग्री flicking द्वारा पूरा किया जा सकता है. डालने प्रणाली के निचले सतह को छूने मत करो.
एक दूसरे 24 अच्छी तरह से 500 / अच्छी तरह से 4 μg / एमएल HBSS में AM Calcein μL युक्त थाली में डालने प्रणाली स्थानांतरण. 37 पर 1 घंटे के लिए सेते ° सी, 5% सीओ _2. Calcein AM समाधान प्रतिदीप्ति पढ़ने से पहले निचले सदन से हटाया नहीं है क्योंकि यह एक nonfluorescent महत्वपूर्ण डाई है कि हरी फ्लोरोसेंट calcein में साइटोसोलिक esterases द्वारा कनवर्ट किया जाता है है.
आक्रमण कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति नीचे पढ़ने फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक पर 494/517 एनएम (पूर्व / एम) के तरंग दैर्ध्य को पढ़ने के लिए है. लाभ सेटिंग empirically निर्धारित किया जा जरूरत है, लेकिन हो सकता है एक मध्य लाभ पर्याप्त प्रारंभ बिंदु होना चाहिए. एक लाभ सेटिंग है कि बहुत अधिक है अत्यधिक फ्लोरोसेंट नमूना के साथ डिटेक्टर के संतृप्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इस सार्थक परिणाम के अधिग्रहण रोक सकता है. Autogain का प्रयोग करें (यदि आपके पाठक पर समर्थित) की सिफारिश नहीं है. एक औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन अपने परिणामों को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह विशेष रूप से उपयोगी है यह पहली बार जब आप इस परख चलाने है.
नोट: यह अत्यंत महत्व का है कि सम्मिलित सिस्टम सही प्लेट मानचित्र का उपयोग करने के लिए पढ़ रहे हैं. लोड हो रहा है थाली नक्शे पर जानकारी के लिए बी.डी. www.bdbiosciences.com या संपर्क बी.डी. तकनीकी सहायता (labware@bd.com) पर तकनीकी बुलेटिन 436 सं देखते हैं. उचित प्लेट अभिविन्यास में अच्छी तरह A1 के साथ ऊपरी बाएँ कोने और BD flacon लोगो सही करने के लिए उन्मुख के रूप में प्लेट रीडर में डाला जाता है.

डेटा कटौती

डेटा के रूप में निम्नलिखित समीकरण में व्यक्त किया है:

पृष्ठभूमि प्रतिशत सेल आक्रमण की गणना पहले घटाया जा सकता है
RFU = रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों.

Disclosures

लेखकों बी.डी. बायोसाइंसेज कि इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और उपकरणों की उत्पादन के कर्मचारी हैं.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD BioCoat Tumor Invasion System	BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells	ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control	BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye	BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling	BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities	PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.

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References

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