Summary
Questo video dimostra come misurare l'invasione delle cellule attraverso inserti in coltura cellulare utilizzando una metodologia basata fluorescenza.
Abstract
La caratteristica delle cellule metastatiche è la loro capacità di invadere attraverso la membrana basale e migrare in altre parti del corpo. Le cellule devono essere in grado di secernere sia proteasi che degradano la membrana basale e migrare in modo da essere invasiva. BD sistema Tumore BioCoat Invasion fornisce cellule con le condizioni che permettono la valutazione della loro proprietà invasive
Protocol
Post-etichettatura e la misura utilizzando BD calceina AM colorante fluorescente
Le cellule sono etichettati per la quantificazione dopo che hanno invaso attraverso il Matrigel BD Matrix e passato attraverso la membrana BD FluoroBlok. Di conseguenza, solo la misura finale di invasione delle cellule possono essere ottenute.
- Crescere le cellule a confluenza ~ 80%.
- Preparare e reidratare il sistema di inserimento.
- Rimuovere il pacchetto di stoccaggio da -20 ° C e permettono di venire a temperatura ambiente.
- Aprire la confezione ed aggiungere 500 microlitri caldo (37 ° C), mezzi di comunicazione verso l'interno dei pozzi inserto. Lasciare la piastra per reidratare per 2 ore a 37 ° C, 5% di CO 2.
Nota: non è necessario reidratare il patinata BD Falcon FluoroBlok 24-pozzetti sistema Inserire che sarà utilizzato come controllo la migrazione delle cellule. - Dopo la reidratazione, rimuovere con attenzione il supporto dai pozzetti inserire senza disturbare lo strato di BD Matrigel Matrix sulla membrana. Il sistema è ora pronto all'uso.
- Preparare sospensioni cellulari da trypsinizing monostrati cellulari e risospendere le cellule in DMEM senza siero a 5 x 10 4 cellule / ml.
Nota: Se si utilizza un diverso tipo di cellule è necessario determinare la densità ottimale di semina. Per determinare la densità di semina ottimale per il vostro tipo di cellulare su una superficie porosa crescita, utilizzare una gamma di densità di semina (cellule / cm 2) che supporti la densità di semina utilizzati su superfici non porose (es. boccette, piatti e piatti). Per esempio, se attualmente seme a 2,5 x 10 5 cellule / cm 2, seme a concentrazioni di cellule diverse tra 5 x 10 4 e 5 x 10 5 cellule / cm 2 per determinare la densità ottimale di semina iniziale. - Aggiungere 500 ml di sospensione cellulare (2,5 x 10 4 cellule) alle camere apicale.
- Aggiungere 750 ml di fattore chemiotattico (5% FBS in DMEM) per ciascuna camera basale, utilizzando le porte del campione per l'accesso.
- Incubare il sistema BioCoat BD tumore invasione e la non patinata BD Falcon FluoroBlok 24-pozzetti Plate per 20-22 ore a 37 ° C, 5% CO 2 nell'atmosfera.
- Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione di media dalle camere apicale. Questo può essere ottenuto sfogliando il contenuto in un contenitore per rifiuti. Non toccare la superficie inferiore del sistema di inserimento.
- Trasferire il sistema di inserire in un secondo 24 pozzetti contenente 500 microlitri / e di 4 mcg / mL calceina AM in HBSS. Incubare per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2. La soluzione calceina AM non viene rimosso dalla camera bassa prima di leggere la fluorescenza, perché è un colorante nonfluorescent vitale che viene convertito in calceina verde fluorescente dalle esterasi del citosol.
- Fluorescenza delle cellule invase viene letto a lunghezze d'onda di 494/517 nm (Es / Em) su un fondo di lettura lettore di piastre a fluorescenza. L'impostazione di guadagno potrebbe essere necessario essere determinati empiricamente, ma un guadagno punto centrale dovrebbe essere un punto di partenza sufficiente. Un guadagno che è troppo alto può portare alla saturazione del rivelatore con il campione altamente fluorescenti, questo può impedire l'acquisizione di risultati significativi. L'uso di autogain (se supportato dal lettore) non è raccomandato. Un microscopio invertito a fluorescenza può essere usato per verificare i risultati, ma è particolarmente utile per fare questo la prima volta che si esegue questo test.
Nota: E 'della massima importanza che i sistemi di inserti vengono letti utilizzando la mappa corretta piatto. Per informazioni sulle mappe di carico piatto vedere BD Bollettino tecnico n ° 436 il www.bdbiosciences.com o contattare il supporto tecnico BD (labware@bd.com). L'orientamento corretto piastra è ben A1 in alto a sinistra e il logo BD Flacone orientata a destra, come il piatto viene inserito nel lettore.
Riduzione dei dati
I dati vengono espressi come nella seguente equazione: 
Fondo possono essere sottratti prima del calcolo di invasione per cento delle cellule
RFU = unità relative fluorescenti.
Disclosures
Gli autori sono dipendenti della BD Biosciences, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD BioCoat Tumor Invasion System | BD Biosciences | 354165 or 354166 | |
| HT-1080 and NIH/3T3 cells | ATCC | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free) | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS) | |||
| BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control | BD Biosciences | 351157 or 351158 | |
| 5% Fetal Bovine Serum in DMEM | |||
| BD Calcein AM Fluorescent Dye | BD Biosciences | 354216 or 354217 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | |||
| BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling | BD Biosciences | 351147 | |
| Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities | PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar. |
References
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