Summary
我们提出了一个
Abstract
膜融合是包膜病毒进入细胞的过程中必不可少的步骤。通常传统的融合检测报告，大量的融合活动，使其难以定量分析的分子步骤的顺序。我们已经开发出体外，双色荧光检测，监视与目标上基本上是流体支持双层的单个病毒颗粒融合动力学。
流感病毒颗粒，是培养一个绿色的染色膜和一个红色的亲水性荧光团染色的病毒内部的亲脂性荧光团。我们一个神经节苷脂含脂双层存款右旋糖酐functionilized玻璃表面上的流通池，孵化平面双层和图像100 x 100微米2区的荧光的病毒颗粒，包含几百个粒子在防治荒漠化公约“，摄像头。成像，红色和绿色的荧光，我们可以同时监控膜染料（绿色）和水含量的颗粒（红色）的行为。
在降低pH值低于融合的pH值值，颗粒会与膜的融合。 Hemifusion，合并外病毒膜与目标膜外单张单张，将作为一种绿色荧光粒子的突然变化可见。后，随后剩下的两个远端单张融合，将形成一个孔，将目标膜下释放病毒颗粒的红色发光的荧光基团。此事件会引起减少单个粒子的红色荧光。最后，从pH敏感的荧光基团，是嵌入在目标膜集成荧光报告的pH值下降的确切时间。
从三个荧光痕迹，所有的重要事件（pH值下降，脂质混合后hemifusion，混合孔隙形成后的内容）现在可以在一个简单的方式和单独的每个粒子中提取。通过收集直方图许多单个粒子的各种转换的运行时间，我们可以判断相应的中间体的寿命。甚至隐藏中间体，没有一个直接的荧光观察，可以直接从显示这些直方图。
Protocol
玻璃盖滑官能
在融合实验中使用的是平面双层支持的葡聚糖水合膜。葡聚糖作为一个平面双层玻璃表面之间的间隔。这可以防止成为停留在玻璃表面的膜元件，并提供病毒粒子的内容可以逃脱后，融合的空间。盖玻片官能通过与环氧硅烷，它允许我们化学债券右旋糖酐玻璃（Elender， 等，1996年）的治疗。
- 排列在陶瓷染色架25毫米的盖玻片，并将其放置到一个jar或烧杯机架。
- 填充10％的实验室高档玻璃器皿洗涤剂溶液的容器中。将在30分钟的超声波清洗机的容器。
- 1M postassium氢氧冲洗去离子水的容器和盖玻片机架，和填充。返回容器浴30分钟sonicator。
- 重复此清洗程序，使用丙酮和乙醇。
- 冲洗水和干燥的coverlips。
- 最后，清洁的盖玻片，用三分钟的氧等离子体脱衣舞。
- 最后的清洁步骤氧化表面，使玻璃均匀的亲水性和反应在下列硅烷步骤。
- 准备3 glycidoxypropyltrimethoxy硅烷在异丙醇0.2％的解决方案。浸泡5分钟，在此解决方案的盖玻片。
- 丢弃硅烷溶液和异丙醇冲洗盖玻片几次。
- 现在涂一层硅烷的盖玻片，但他们必须治愈让硅烷共价债券的玻璃。放在烤箱设置为80度摄氏一小时的盖玻片。
- 虽然在盖玻片固化，掂量出右旋糖酐500，并准备了30％W / V解决方案。预热水将有助于溶解。我们将使用约1毫升每盖玻片的解决方案。一旦葡聚糖溶解，消泡在真空干燥器的解决方案。
- 当硅烷盖玻片完成固化，从陶瓷机架中删除，并安排他们平面上的一个塑料冰柜盒里面。用1毫升吸管盖顶面〜1毫升右旋糖酐解决方案的每个盖玻片。关闭冷冻箱，并在一个安静的地方为24-36小时离开。
- 在抓盖玻片，用塑料镊子倒出多余的葡聚糖和更换成陶瓷机架。在水冲洗盖玻片几次，让盖玻片，在水中浸泡48小时。的罐子可表上方肩轻轻地激动。
- 在烤箱设置为80摄氏度，并储存在真空干燥器干燥的盖玻片。
脂质体的制备
支持的脂质双层脂质体吸附葡聚糖官能盖玻片组成。吸附脂质体融合在一起海誓山盟，直到平在其表面的膜破裂和传播。
- 一个典型的脂质体配方，用于检测由1,2，dioleoyl - SN -甘油- 3 - phosphocholine（DOPC），1 -油酰- 2 - 棕榈酰- SN -甘油- 3 - phosphocholine（POPC），胆固醇，牛脑Disialoganglioside（GD 1A），和N -（（6 - （biotinoyl）氨基）hexanoyl）-1,2 - dihexadecanoyl - SN -甘油- 3 - phosphoethanolamine在X10 -5 4:4:2:0.1:5比例。所有组件都存储在氯仿或三氯甲烷和甲醇的解决方案。
- 准备转移到玻璃试管中的每个组件数量，包含两个脂质微摩尔混合物。溶剂蒸发下氩气或氮气流。留在两个小时的真空干燥器的试管中取出剩余的溶剂。
- HNE缓冲区在400微升（5毫米HEPES，145毫米氯化钠，0.1毫米EDTA），重悬干脂质膜。
- 暂停转移到塑料离心管。冻结暂停在液氮浴和解冻在温水澡。重复冻结/解冻周期的四倍。
- 装配与100 nm的聚碳酸酯滤膜过滤的脂质挤出机，挤出的脂质悬液25倍。暂停挤压后会出现更加透明。
- 脂质体应使用上，他们准备的一天。他们可在室温下保存，直至使用。
微流控流细胞制备
一个简单的微流体流动细胞是由双节棍磁带夹在一个石英片和官能盖玻片。
- 获取一个20x20x3毫米的石英片。使用钻石毛刺对立面上钻两个1毫米的孔。
- 剪下从双节棍带表的20平方毫米，并用刀片，切出15 x 2毫米的部分，从中心。
- 揭去一面磁带备份，磁带和坚持的夸脱ž幻灯片。对方坚持一个官能盖玻片。
- 聚乙烯管材削减两个20厘米的长度和它们在石英片上的孔插入。
- 5分钟环氧胶密封的流动池。
- 胶水固化时，黄金的流动细胞和油管用缓冲液。
- 一个受支持的脂质双分子层，可以形成在这个阶段，进入渠道的脂质体混悬液约80微升。
病毒粒子标签
- H3N2型流感A（X - 31）是通常用于融合实验，但已成功用于其他流感毒株和其他病毒。
- 病毒是两种不同的荧光染料标记，以便检测hemifusion和孔隙形成。
- 溶解在HNE缓冲区sulforhodamine B（SRB），20毫米的解决方案。结合病毒悬液10微升20微升的染料溶液，并在室温下20小时内离开。在此期间，染料会慢慢积累的病毒颗粒内。
- 删除多余的染料，通过PD - 10脱盐柱的病毒悬液。病毒如果有足够的材料，色带可以看出，在列。这个频段包含标记的病毒，可以收集，因为它是洗脱。
- 如果没有带是可见的，收集200微升的分数和确定分数包含标记病毒通过测量565 nm处的吸收分光光度计。病毒应在总量约0.8毫升洗脱。
- 标签的SRB标记的病毒悬液加入13微升至2毫米的二甲基甲酰胺（DMF）十八烷基罗丹明110（Rh110C18）解决方案的病毒包膜。
- 搅拌管连接到实验室肩暂停3个小时离开。
- 使用前面所述的PD - 10脱盐柱净化过剩Rh110C18病毒。
显微镜配置
配备高NA油浸物镜适合全内反射荧光显微镜荧光显微镜上进行实验。氩/氪气激光纳米线488和568，是用来激发Rh110C18和SRB标记的病毒。每个标签的同时成像是通过分裂与分色镜的绿色和红色荧光发射和独立集中到单独的一个电子倍增CCD相机半的图像。
执行检测
执行涉及的融合实验流细胞内的生化成分逐步装配：装配平面脂双层，对接标记的病毒颗粒，涂层表面用荧光素，并开始与低pH值的缓冲（图1A）的反应。
- 山显微镜舞台上的流通池，流速度每分钟40微升注射器泵出口管连接。
- 清除多余的脂质体的流通渠道流入300微升HNE。
- 聚焦显微镜和调整激光功率350瓦/厘米2的488纳米的光，70瓦/厘米2 568纳米的光照亮表面。如果您使用的是一个60X NA 1.45油浸物镜，设置激光强度分别为100微瓦和20微瓦，。
- 标记病毒（1 / 100稀释）泵入流通池。由于病毒扩散到流道底部表面，粒子将开始坚持在脂质双层中的神经节苷脂。
- 当一个适合停靠的病毒颗粒密度已达到（到1000左右每视野颗粒）。开关的入口管的解决方案包含两个微克每毫升荧光标记的链霉。标记链霉素再加上双层脂质分子结合，并最终将会看到一个暗淡的绿色背景。
- 洗流道与300微升的HNE。
- 选择图像区域，聚焦显微镜和CCD相机准备时间已过图像采集。设定曝光时间为100 ms和收集率在10赫兹的帧。
- 开始融合，在酸性缓冲液含有10 mM柠檬酸钠和140毫米氯化钠中流动。缓冲区的pH值应调整被检测的pH值低于该病毒的关键。 X - 31熔断器在pH低于5.5。
代表性的成果
图1b显示了双层停靠融合病毒粒子之前和期间的快照。每个衍射极限点，代表一个单独的病毒粒子。红色和绿色荧光成像到CCD相机的顶部和底部的部分，从而使病毒包膜和内容标签的同步观测。通常有两倍多点相比，在绿色通道红色，这反映内容染料相比效率较低的标签，信封标签。从表面发射的约束荧光绿色背景荧光消失后的柠檬酸缓冲液的到来，并允许确定的核聚变反应的开始时间。病毒包膜弥漫在整个hemifusion秸秆淬火Rh110C18 Hemifusion事件阵阵绿色荧光检测，并在平面膜稀释。向外扩大荧光灯云可以看出hemifused颗粒周围，展现在平面膜染料的脂肪酰基相连的自由扩散。孔隙的形成是从SRB的红色荧光衰变被困在病毒颗粒的内部观察。融合孔的开放，使染料逃进下面的观察区域的平面双层和出的水空间。
每个粒子的荧光强度的轨迹，绘制从单个粒子的综合强度，促进hemifusion和孔隙的形成（图1C）倍的产量和决心。 Hemifusion和孔隙形成事件的时间是作为一个Rh110C18荧光爆裂或SRB信号衰减的最大坡度发生在哪个点确定。在一个成功的实验中，约50％Rh110C18产量dequenching信号，30％的SRB颗粒标记标记颗粒提供可用的信号。同时染料标记的颗粒，约10％，表明脂质混合孔隙形成的信号。
图2A - c显示hemifusion和孔隙形成的滞后时间从一个典型的实验的分布。图2d - F显示从五个相同的条件下进行的实验相结合的事件的事件分布。即使有一个温和的意见，直方图的形状是显而易见的。因为每一个实验是通过检测pH值下降时间同步，可以相结合，并多次实验，可以得到详细的限制中间步骤率的信息。
图1实验设计。 A）病毒颗粒两种荧光染料标记，监察hemifusion和融合孔的形成的动力学。荧光是由高NA显微镜物镜收集到的CCD成像。二）荧光图像（右）前（左）和在个别病毒颗粒的融合。每幅图像的顶部和底部一半对应红色和绿色的荧光，分别支持双层面积相同〜50 × 100毫米2。三）红色SRB的病毒含量示踪（上部跟踪）的荧光强度，绿色Rh110C18膜染料（中等跟踪），和荧光pH传感器（低跟踪）提供之间的pH值下降，hemifusion，并融合后的确切时间。请点击这里看到图1的放大版本。
图2荧光标记的病毒融合动力学。分布的pH值下降，hemifusion（A，D）和孔隙的形成（B，E）之间所经过的时间。上升和衰减的分布，表明存在多个中间步骤。 hemifusion为单个粒子的融合孔的开放之间的过渡，是指数分布，表明单一的限速步骤。小组交流展示一个单一的实验结果。面板的DF是由五个独立的实验，在相同条件下进行编译。请点击这里看大图图2。
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Discussion
流体和连续支持的脂质双层的准备工作都具有挑战性。微量污染物质或表面缺陷会阻止双层扩散。仔细清洗和沉积一层均匀的葡聚糖是必不可少的。
长时间的病毒颗粒成像可以漂白的荧光标记，或使他们成为灭活。在生物成像和单分子领域的照片这种损害是众所周知的，一般认为源于激发荧光基团的产生活性氧。为了最大限度地减少照片损伤，我们一般尽量减少激发激光功率，避免长时间暴露实验开始之前。从报道的几个氧清除系统的缓冲区中的氧气耗尽，可能证明是有用的的。
约瞬态中间状态的信息，需要精确同步核聚变反应的能力。使用和流量的进油管和流通池通道的死体积的因素，可以限制同步。融合中性酸性pH值的缓冲交换发起。然而，酸性缓冲通过入口管旅行到流通池，两个缓冲区之间的接口，通过扩散混合，成为良好定义逐步减少。在双层表面产生pH梯度趋于模糊的开始时间的决心。此外，由于融合动力学是依赖于质子浓度，在实验开始的pH梯度可能对结果的解释复杂。在这里的实验表明，融合的动力学比pH值的过渡时间要慢得多，和渐变效果并不显着影响融合动力学。目前，我们正在对我们的流动细胞的修改，将使我们能够总理所需的缓冲区之前的流量转移到流通池入口管。
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Acknowledgments
这项工作是支持由美国国立卫生研究院拨款AI57159（SCH）和AI72346（AMvO）。 SCH是霍华德休斯医学研究所的研究员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
