Summary
Nós apresentamos um
Abstract
Fusão de membrana é um passo essencial durante a entrada de vírus encapsulados dentro das células. Ensaios de fusão convencionais tipicamente relatório sobre um grande número de eventos de fusão, tornando-se difícil analisar quantitativamente a seqüência de passos moleculares envolvidos. Nós desenvolvemos uma in vitro, duas cores-ensaio de fluorescência para monitorar cinética de fusão única partículas do vírus com uma bicamada destino em um apoio essencialmente fluido.
Partículas de gripe viral são incubados com um fluoróforo verde lipofílico para manchar a membrana e um fluoróforo vermelho hidrofílico para manchar o interior viral. Nós depositamos uma bicamada lipídica contendo gangliosídeo na superfície do vidro dextran-functionilized de uma célula de fluxo, incubar as partículas virais na bicamada planar e imagem da fluorescência de 100 x 100 mm 2 de área, contendo várias centenas de partículas, em um CCD câmera. Por imagem tanto a fluorescência vermelha e verde, podemos monitorar simultaneamente o comportamento do corante de membrana (verde) e do conteúdo aquoso (vermelho) das partículas.
Após a redução do pH para um valor abaixo do pH de fusão, as partículas irão fundir com a membrana. Hemifusão, a fusão do folheto externo da membrana viral com o folheto externo da membrana-alvo, será visível como uma mudança súbita na fluorescência verde de uma partícula. Após a fusão subseqüente dos dois restantes folhetos distal de um poro será formado eo fluoróforo vermelho-emitting na partícula viral será lançado sob a membrana alvo. Este evento dará origem a uma diminuição da fluorescência vermelha de partículas individuais. Finalmente, a fluorescência integrada a partir de um fluoróforo pH-sensíveis que está incorporado na membrana-alvo relatórios sobre o momento exato da queda de pH.
Do três-tempo de fluorescência traços, todos os eventos importantes (queda de pH, lipídios mistura no conteúdo hemifusão, misturando sobre a formação de poros) podem agora ser extraídas de uma maneira direta e para cada partícula individualmente. Coletando os tempos decorridos para várias transições para muitas partículas individuais em histogramas, podemos determinar a vida útil dos intermediários correspondentes. Mesmo intermediários ocultos que não têm um observáveis direta fluorescentes podem ser visualizados directamente a partir destes histogramas.
Protocol
Funcionalização lamínula de vidro
A bicamada planar utilizada no ensaio de fusão é apoiada em um filme hidratado de dextran. Dextran atua como um espaçador entre a bicamada planar e superfície de vidro. Isso evita que componentes da membrana de tornar-se preso na superfície do vidro e também fornece espaço para que o conteúdo de uma partícula do vírus pode escapar após a fusão. Lamínulas de vidro são funcionalizados através de tratamento com um epóxi silano, o que nos permite quimicamente vínculo dextran ao vidro (Elender, et al. 1996).
- Organizar 25 lamínulas mm em um suporte de coloração de cerâmica, e coloque a cremalheira em uma jarra ou copo.
- Encha o recipiente com uma solução a 10% do laboratório glassware detergente grau. Coloque o recipiente em um limpador ultra-sônico por 30 minutos.
- Lavar o recipiente e rack lamínula com água deionizada, e reabastecer com hidróxido de postassium 1M. Devolver o recipiente para o banho sonicador por mais 30 minutos.
- Repita este procedimento de limpeza utilizando acetona e etanol.
- Lavar a coverlips em água e seco.
- Por fim, limpe as lamelas com uma stripper plasma de oxigênio por três minutos.
- A etapa de limpeza última oxida a superfície, fazendo com que o vidro uniformemente hidrofílicas e reativas nas etapas seguintes silanização.
- Preparar uma solução 0,2% de 3-glycidoxypropyltrimethoxy silano em isopropanol. Mergulhe as lamelas nesta solução por cinco minutos.
- Descartar a solução de silano e enxaguar os tempos lamínulas vários isopropanol.
- As lamelas estão agora revestido com uma camada de silano, mas eles devem ser curada para permitir que o silano para unir covalentemente para o vidro. Coloque as lamelas em um forno definido como 80 graus Celsius durante uma hora.
- Enquanto as lamelas são a cura, pesar dextran 500 e preparar uma solução de 30% w / v. Pré-aquecimento da água irá facilitar a dissolução. Nós vamos usar cerca de 1 ml desta solução por lamínula. Uma vez que o dextran se dissolveu, defoam a solução em um dessecador a vácuo.
- Quando as lamelas silanizadas terminar de cura, removê-los do rack de cerâmica plana e organizá-los no interior de uma caixa de plástico congelador. Use uma pipeta de 1 ml para cobrir a superfície superior de cada lamela com ~ 1 ml da solução de dextran. Feche a caixa de freezer e deixe em um local tranquilo para 24-36 horas.
- Ao segurar as lamelas com uma pinça de plástico, despeje o excesso de dextran e substituí-los no rack de cerâmica. Enxágüe os tempos lamínulas várias em água, e permitir que as lamelas de molho em água por 48 horas. O frasco pode ser agitado suavemente em um rotador de mesa.
- Seca as lamelas em um forno definido como 80 graus Celsius e armazenar em um dessecador a vácuo.
Preparação de lipossomas
Bicamadas lipídicas suportados são formadas por adsorção lipossomas para uma lamela dextran funcionalizada. O adsorvido fusível lipossomas uns com os outros até rupturas da membrana e se espalha sobre a superfície plana.
- A formulação típica lipossomas usado no ensaio consiste em 1,2, dioleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DOFC), 1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), o colesterol, o cérebro dos bovinos Disialoganglioside (GD 1a), e N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-3-phosphoethanolamine em uma proporção de 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Todos os componentes são armazenados em clorofórmio ou clorofórmio e soluções de metanol.
- Prepare uma mistura contendo dois micromoles de lipídios através da transferência de volumes de cada componente em um tubo de ensaio de vidro. Evaporar o solvente sob um fluxo de argônio ou gás nitrogênio. Remover o solvente restante, deixando o tubo de ensaio num exsicador de vácuo por duas horas.
- Ressuspender o filme lipídico seco em 400 microlitros de tampão HNE (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).
- Transferir a suspensão para um tubo de microcentrífuga de plástico. Congelar a suspensão em um banho de nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria quente. Repita este ciclo de congelamento / descongelamento quatro vezes.
- Montar uma extrusora de lipídios com 100 nm de policarbonato filtro de membrana, e expulsar a suspensão lipídica 25 vezes. A suspensão deve aparecer para ser mais transparentes após a extrusão.
- Lipossomas deve ser usado no dia em que são preparados. Eles podem ser armazenadas em temperatura ambiente até ser usado.
Preparação celular microfluídicos fluxo
A célula de fluxo simples microfluídicos é feita por um sanduíche de fita dupla pau entre um slide de quartzo e uma lamela funcionalizada.
- Obter um slide 20x20x3 milímetros de quartzo. Use uma broca de diamante para furar dois furos 1 mm em lados opostos.
- Corte um quadrado 20 milímetros de uma folha de fita dupla pau, e usando uma lâmina de barbear, cortar uma secção de 15 x 2 mm a partir do centro.
- Descole um dos lados do suporte de fita, e aderir a fita para o quartslides z. Aderir o outro lado para uma lamela funcionalizada.
- Corte dois comprimentos de 20 cm de tubo de polietileno e inseri-los nos furos na lâmina de quartzo.
- Selar a célula de fluxo com cola epóxi 5 minutos.
- Quando a cola tem cura, a célula principal de fluxo e tubo com tampão.
- A bicamada lipídica suportados podem ser formadas nessa fase por cerca de 80 microlitros de desenho da suspensão de lipossomas para os canais.
Rotulagem partícula do vírus
- H3N2 influenza A (X-31) é normalmente utilizado para o ensaio de fusão, mas outras cepas de gripe e outros vírus têm sido usadas com sucesso.
- Vírus é rotulado com até dois diferentes corantes fluorescentes para permitir a detecção de hemifusão e pore-formação.
- Dissolver sulforhodamine b (SRB) em tampão HNE para fazer uma solução 20 mM. Combine 20 microlitros da solução de corante com 10 microlitros da suspensão viral, e deixar em temperatura ambiente por 20 horas. Durante este período, a tintura vai lentamente se acumulam no interior das partículas de vírus.
- Retire o excesso de corante, passando a suspensão de vírus através de uma coluna do PD-10 dessalinização. Se o material viral suficiente é usado, uma faixa colorida pode ser visto na coluna. Esta banda contém vírus identificados e podem ser coletados como é eluída.
- Se nenhuma banda é visível, recolher 200 frações microlitro e determinar quais frações contêm vírus rotulados medindo 565 nm a absorção em um espectrofotômetro. O vírus deve eluir em um volume total de aproximadamente 0,8 ml.
- Etiqueta do envelope viral, adicionando 13 microlitros de uma formamida 2 mM dimetil (DMF) solução de octadecil rodamina 110 (Rh110C18) para a suspensão de vírus SRB rotulados.
- Agitar a suspensão, anexando o tubo de laboratório a um rotator e deixe por 3 horas.
- Purificar o vírus de Rh110C18 em excesso com uma PD-10 coluna de dessalinização como descrito anteriormente.
Configuração microscópio
O experimento é realizado em um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de alta de imersão em óleo NA adequado para microscopia de fluorescência reflexão interna total. A 488 e 568 nm linhas de um argônio / gás krypton de laser são usados para excitar o vírus Rh110C18 e SRB rotulados. Gravação simultânea de cada etiqueta é realizado através da divisão da emissão de fluorescência verde e vermelho com um espelho dicróico e independentemente focando as imagens em metades separadas de um elétron câmera CCD multiplicando.
Realização do ensaio
Execução do ensaio de fusão envolve uma montagem passo a passo dos componentes bioquímicos no interior da célula de fluxo: a montagem da bicamada lipídica planar, docking de partículas do vírus rotulados, revestimento da superfície com fluoresceína e início da reação com tampão de pH baixo (Figura 1A) .
- Monte o fluxo de células para o palco microscópio, e anexar a tubulação de saída para uma bomba de seringa definir a fluir a uma taxa de 40 microlitros por minuto.
- Abrir os canais de fluxo de lipossomas excesso de fluxo em 300 microlitros de HNE.
- O foco do microscópio e ajustar a potência do laser para iluminar a superfície com 350 W / cm 2 de 488 nm e luz 70 W / cm 2 de 568 nm de luz. Se você estiver usando uma 1,45 NA 60x objetivo de imersão em óleo, defina a intensidade do laser de 100 Watts e 20 Watts micro micro, respectivamente.
- Bomba de vírus rotulados (diluído 1 / 100) em uma célula de fluxo. Como o vírus se difunde para a superfície inferior do canal de fluxo, as partículas começam a aderir ao gangliosídeo incorporados na bicamada lipídica.
- Quando uma densidade adequada de partículas do vírus acoplado foi atingido (até cerca de 1000 partículas por campo de visão). Mudar a tubulação de entrada para uma solução contendo dois microgramas por mililitro estreptavidina fluoresceína rotulados. A estreptavidina marcada irá se ligar a moléculas lipídicas biotina acoplado na bicamada, e eventualmente um fundo verde escuro será visível.
- Lave o canal de fluxo com 300 microlitros de HNE.
- Escolha uma área de imagem, o foco do microscópio e preparar a câmara CCD de tempo decorrido de aquisição de imagem. Definir o tempo de exposição de 100 ms e recolher os quadros a uma taxa de 10 Hz.
- Iniciado por fusão fluindo em um buffer de ácido contendo 10 mM citrato de sódio e 140 mM NaCl. O pH do tampão deve ser ajustada para ser abaixo do pH crítico do vírus sendo ensaiadas. X-31 fusíveis em pH abaixo de 5,5.
Resultados representante
A Figura 1B mostra instantâneos de bicamada virions acoplado antes e durante a fusão. Cada ponto de difração limitada representa uma partícula do vírus individual. Fluorescência vermelha e verde têm sido fotografado separadamente para as metades superior e inferior de uma câmera CCD, que permite a observação simultânea do envelope viral e etiquetas de conteúdo. Há tipicamente o dobro de pontos no canal verde em comparação como vermelho, e isso reflete a menor eficiência de rotulagem pelo corante de conteúdo em comparação com o rótulo de envelope. A fluorescência emitida fundo verde da superfície ligada fluoresceína desaparece após a chegada do tampão citrato e permite a determinação do horário de início da reação de fusão. Hemifusão eventos são detectados como rajadas de fluorescência verde como o Rh110C18 extinto no envelope viral difunde em todo o talo hemifusão e é diluída na membrana planar. Uma nuvem se expandindo para fora fluorescentes podem ser vistos em torno de partículas hemifused, demonstrando livre difusão do corante graxos-acil ligado na membrana planar. Formação de poros é observado como a decadência da fluorescência vermelha da SRB preso no interior das partículas virais. A abertura de um poro de fusão permite que o corante de escapar para o espaço aquosa abaixo da bicamada planar e fora da região de observação.
Trajetórias intensidade de fluorescência para cada partícula, traçados a partir da intensidade integrada de partículas individuais, facilitar a determinação do rendimento e tempos de hemifusão e formação de poros (Fig. 1C). Horários dos eventos hemifusão e formação de poros são determinadas como o ponto em que a inclinação máxima de uma explosão Rh110C18 fluorescência ou deterioração do sinal SRB ocorre. Em uma experiência de sucesso, cerca de 50 por cento das partículas marcadas com sinais Rh110C18 rendimento dequenching, e 30 por cento das partículas SRB rotulados dar sinal utilizável. Das partículas marcadas com ambos os corantes, aproximadamente 10 por cento mostram sinais de ambos os lípidos formação de mistura e poros.
Fig. 2A-C mostra a distribuição dos hemifusão e tempos de formação dos poros lag a partir de uma experiência típica. Fig.2D-F mostra distribuições caso de eventos combinados a partir de cinco experimentos realizados nas mesmas condições. Mesmo com um número modesto de observações, a forma dos histogramas é aparente. Porque cada experiência é sincronizado por detecção do tempo de queda do pH, as experiências múltiplas podem ser combinadas e informações detalhadas sobre a limitação de taxa passos intermediários podem ser obtidos.
Figura 1. Delineamento experimental. A) partículas de vírus são rotulados com dois corantes fluorescentes para monitorar a cinética de hemifusão e formação de poros de fusão. Fluorescência é coletada por uma objetiva de microscópio de alta NA e fotografada em um CCD. B) imagens de fluorescência antes (esquerda) e durante (direita) a fusão do indivíduo partículas virais. Metade superior e inferior de cada imagem corresponde à fluorescência vermelha e verde, respectivamente, da área de ~ 50 x 100 mm 2 mesmo da bicamada suportados. C) A intensidade de fluorescência do marcador vermelho SRB conteúdo viral (traço superior), o verde Rh110C18 membrana corante (traço médio), eo sensor de pH de fluoresceína (traço inferior) oferecem horários exatos decorrido entre a queda de pH, hemifusão, e de fusão. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
Figura 2. Cinética de fusão do vírus fluorescente etiquetado. Distribuições do tempo decorrido entre a queda de pH e hemifusão (A, D) e formação de poros (B, E). A ascensão e decadência das distribuições indicam a presença de vários passos intermediários. A transição entre hemifusão e abertura de um poro de fusão para partículas individuais é distribuído exponencialmente, o que sugere um passo limitante da velocidade única. AC painéis mostram os resultados de uma experiência única. DF painéis são compilados a partir de cinco experimentos separados realizados nas mesmas condições. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.
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Discussion
Preparação de fluido e contínuo bicamadas lipídicas suportados pode ser um desafio. Traços de contaminação defeitos de material ou superfície vai evitar a propagação de bicamadas. Limpeza cuidadosa e deposição de uma camada uniforme de dextran são essenciais.
Imagem prolongada de partículas do vírus podem lixívia as etiquetas fluorescentes ou levá-los a tornar-se desativado. Foto-dano deste tipo é bem conhecido na bio-imagem e campos única molécula e é acreditado geralmente para-tronco a partir da geração de espécies reativas de oxigênio pelos fluoróforos animado. Para minimizar os danos foto-, que geralmente minimizar a potência do laser de excitação e evitar a exposição prolongada antes de iniciar o experimento. Depleção de oxigênio dos buffers com um dos sistemas de oxigênio várias limpeza relatados podem ser úteis.
A capacidade de obter informações sobre estados intermediários transitórios exige que a reação de fusão ser precisamente sincronizados. A vazão eo volume de mortos do tubo de admissão e canais célula de fluxo são fatores que podem limitar a sincronização. Fusão é iniciada através da troca de neutro para pH ácido. No entanto, como o tampão ácido viaja através do tubo de entrada na célula de fluxo, a interface entre os dois buffers mistura através da difusão e torna-se progressivamente menos bem definidos. O gradiente de pH, resultando na superfície bicamada tende a diluir-se a determinação da hora de início. Além disso, desde a fusão cinética depende da concentração de prótons, um gradiente de pH no início do experimento pode complicar a interpretação dos resultados. No experimento demonstrado aqui, a cinética de fusão é muito mais lento que o tempo de transição, pH e do efeito de gradiente não afeta significativamente a cinética de fusão. Estamos atualmente trabalhando em modificações para as células do nosso fluxo que nos permita preparar o tubo de admissão com o buffer desejado antes de desviar o fluxo para a célula de fluxo.
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Acknowledgments
O trabalho foi suportado pelo NIH concede AI57159 (para SCH) e AI72346 (para AMvO). SCH é um Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
