Summary
Biz mevcut bir
Abstract
Membran füzyon zarflı virüslerin hücre içine girişi sırasında önemli bir adım. Konvansiyonel füzyon deneyleri genellikle zor ilgili moleküler adımları sırası kantitatif analiz yapma, füzyon olayları çok sayıda rapor. Biz, in vitro bir hedef bilayeri aslında bir sıvı desteği ile tek bir virüs parçacıkları eritme kinetiği izlemek için iki renkli floresan tahlil geliştirdik.
Grip viral parçacıkların, membran ve kırmızı bir hidrofilik fluorofor viral iç leke leke yeşil bir lipofilik fluorofor ile inkübe edilir. Biz bir akış hücresi dekstran-functionilized cam yüzeyinde bir gangliozid içeren çift katlı lipid mevduat, bir CCD parçacıkların yüzlerce içeren, düzlemsel bilayeri ve görüntü 100 x 100 mikron 2 alan floresan viral parçacıkların inkübe kamera. Görüntüleme hem de kırmızı ve yeşil floresan, biz aynı anda membran boya (yeşil) ve sulu içeriği (kırmızı) parçacıkların davranışlarını izlemek.
Füzyon pH altında bir değere pH düşürücü üzerine, partiküllerin membran ile sigorta. Hemifusion, hedef zarının dış broşür ile viral zarının dış broşürün birleştirilmesi, yeşil floresan bir parçacığın ani bir değişim olarak görülebilir. Gözenek kalan iki distal broşür sonraki füzyon üzerine kurulacaktır ve viral partikül kırmızı yayan fluorofor hedef membran altında piyasaya sürülecek. Bu olay bireysel parçacıkların kırmızı floresan bir azalmaya yol açacaktır. Son olarak, hedef membran gömülü olduğu bir pH duyarlı fluorofor entegre floresan pH damla tam zamanı bildirir.
Üç floresan-time izleri, tüm önemli olaylar (pH düşmesi, gözenek oluşumu üzerine karıştırma hemifusion, içerik üzerine karıştırma lipid) kolay bir şekilde ve tek tek her parçacık için ayıklanır. Histogramlar birçok bireysel parçacıklar için çeşitli geçişler için geçen süreleri toplayarak, ilgili ara yaşamlarda belirleyebilirsiniz. Doğrudan bir floresan gözlemlenebilir yoksa bile gizli ara bu histogramlar doğrudan görüntülenebilir.
Protocol
Cam kapak kayma işlevsellik
Füzyon tayininde kullanılan düzlemsel bilayeri dekstran sulu film desteklenmektedir. Dekstran düzlemsel bilayeri ve cam yüzeyi arasında boşluk gibi davranır. Bu cam yüzey takılıp haline membran bileşenleri önler ve aynı zamanda bir virüs parçacık içeriği füzyon üzerine kaçmak için yer sağlar. Cam lamelleri bize kimyasal bağ dekstran cam (Elender, ve ark 1996) sağlar silan epoksi ile tedavi yoluyla Fonksiyonlu.
- Seramik boyama raf 25 mm lamelleri düzenleyin ve bir kavanoz veya behere rafa yerleştirin.
- Konteyner% 10 laboratuvar notu züccaciye deterjan solüsyonu ile doldurun. 30 dakika boyunca ultrasonik temiz kap yerleştirin.
- Deiyonize su ile, konteyner ve kapak rafı ve dolum 1M postassium hidroksit ile durulayın. Başka bir 30 dakika banyo sonikatör konteyner dönün.
- Aseton ve etanol kullanılarak bu temizlik işlemi tekrarlayın.
- Su ve kuru coverlips durulayın.
- Son olarak, üç dakikada bir oksijen plazma striptizci lamelleri temizleyin.
- Son temizlik adım, cam aşağıdaki silanization adımları düzgün hidrofilik ve reaktif, yüzey oksitler.
- Isopropanol 3-glycidoxypropyltrimethoxy silan% 0.2 solüsyon hazırlayın. Beş dakika için bu çözüm lamelleri bırakın.
- Silan çözüm atın ve isopropanol lamelleri birkaç kez yıkayın.
- Lamelleri silan bir tabaka ile kaplıdır, ancak cam kovalent bağ silan izin tedavi edilmelidir. Bir saat boyunca 80 santigrat dereceye ayarlanmış fırında lamelleri yerleştirin.
- Lamelleri kuruyan, dekstran 500 tartmak ve% 30 w / v çözeltisi hazırlamak. Su Ön ısıtma çözülme yardımcı olacaktır. Biz, lamel başına bu çözüm yaklaşık 1 ml kullanabilirsiniz. Dekstran çözünmüş sonra, bir vakum desikatörde çözüm defoam.
- Silanlanmış lamelleri kür bitirdiğinizde, seramik rafa kaldırmak ve onları plastik bir dondurucu kutusunun içine düz düzenlemek. Dekstran çözüm ~ 1 ml her lamel üst yüzeyi kapsayacak şekilde 1 ml pipet kullanın. Dondurucu kutusunu kapatın ve 24-36 saat boyunca sessiz bir yerde bekletin.
- Plastik forseps ile lamelleri açgözlü, aşırı dekstran seramik rafın içine dökün ve bunların yerine. Lamelleri su birkaç kez durulayın ve lamelleri 48 saat süreyle su ile ıslatın. Kavanozu hafifçe bir masa üstü rotator ajite olabilir.
- 80 santigrat derece ve bir vakum desikatörde saklayın ayarlanmış fırında lamelleri kurulayın.
Lipozom Hazırlık
Desteklenen çift katlı lipit katmanını dekstran Fonksiyonlu lamel lipozomlar adsorblama oluşur. Zar yırtıkları ve düz bir yüzey üzerinde yayılır kadar birbirleri ile adsorbe lipozomlar sigorta.
- Tayininde kullanılan tipik bir lipozom formülasyonu 1,2 oluşur, dioleoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (DOPC), 1-oleoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (POPC), kolesterol, sığır beyin Disialoganglioside (GD 1a) ve N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-Glycéro-3-phosphoethanolamine 4:4:2:0.1:5 x10 -5 'lik bir oran. Tüm bileşenleri kloroform veya kloroform ve metanol çözümleri saklanır.
- Bir cam tüpe aktararak her bir bileşenin hacimleri iki mikromolden lipid içeren bir karışım hazırlayın. Argon veya azot gazı akışı altında çözücü buharlaşır. Iki saat için bir vakum desikatörde test tüpü bırakarak kalan solvent çıkarın.
- HNE tampon 400 mikrolitre (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) kurutulmuş lipid filmi tekrar
- Süspansiyon, plastik bir mikrosantrifüj tüp aktarın. Sıvı azot banyo ve sıcak su banyosu bir çözülme içinde süspansiyon dondurun. Bu donma / çözülme döngüsü dört kez tekrarlayın.
- 100 nm polikarbonat membran filtre ile lipid ekstruder birleştirin ve lipid süspansiyon 25 kez a'ya. Ekstrüzyon sonra daha şeffaf olması için süspansiyon görünmelidir.
- Lipozomlar hazırlanır gün kullanılmalıdır. Kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında saklanabilir.
Mikroakışkan akışı hücre hazırlığı
Mikroakışkan basit bir akış hücresi, bir kuvars slayt ve Fonksiyonlu lamel arasında çift kaset sopa sandviç tarafından yapılır.
- 20x20x3 mm kuvars slayt alın. Karşı tarafta iki adet 1 mm delik bir elmas tur kullanın.
- Çift kaset sopa bir levha 20 mm kare kesilmiş ve bir jilet kullanarak merkezine 15 x 2 mm bölümü kesip.
- Bir tarafı, teyp yedekleme ve litre bant uymak soyunz slayt. Fonksiyonlu lamel diğer tarafında uyun.
- Polietilen boru, iki adet 20 cm uzunlukta kesin ve kuvars slayt deliklerin içine yerleştirin.
- 5 dakikalık epoksi yapıştırıcı ile akış hücresi Seal.
- tamponu ile tutkal tedavi, asal akış hücresi ve tüp.
- Desteklenen bir çift katlı lipid kanallar içine lipozom süspansiyon yaklaşık 80 mikrolitre çizerek, bu aşamada oluşturulabilir.
Virüs parçacık etiketleme
- H3N2 influenza A (X-31) tipik füzyon tayini için kullanılan, ancak, diğer grip suşlarının ve diğer virüsleri başarılı bir şekilde kullanılmıştır.
- Virüs hemifusion ve gözenek oluşumu tespit izin vermek için iki farklı floresan boyalar ile etiketlenir.
- 20 mM bir çözüm yapmak için HNE tampon sulforhodamine b (SRB) eritin. 10 mikrolitre viral süspansiyon ile boya çözüm 20 mikrolitre birleştirin ve oda sıcaklığında 20 saat bırakın. Bu dönemde, boya yavaş yavaş virüs parçacıkları birikebilir.
- PD-10 tuzsuzlaştırma sütun aracılığıyla virüs süspansiyon geçerek aşırı boya çıkarın. Yeterli viral malzeme kullanılması durumunda, renkli bir bant sütununda görülebilir. Bu band etiketli virüs içerir ve yıkandı, olarak toplanabilir.
- Hiçbir grubun görünmüyorsa, 200 mikrolitrelik kesirleri toplamak ve bir spektrofotometre ile 565 nm emme ölçerek virüs etiketli içeren fraksiyonları belirlemek. Toplam hacminin yaklaşık 0.8 ml virüs Zehir gerekir.
- SRB etiketli virüs süspansiyonu 13 mikrolitre octadecyl rodamin 110 (Rh110C18) 2 mM dimetil formamid (DMF) çözümü ekleyerek viral zarf etiketleyin.
- Süspansiyon bir laboratuvar rotator tüp ekleyerek karıştırın ve 3 saat bekletin.
- Daha önce de açıklandığı gibi, PD-10 tuzsuzlaştırma sütun kullanarak aşırı Rh110C18 virüs arındırın.
Mikroskop yapılandırma
Deney, toplam iç yansıma floresan mikroskopi için uygun bir yüksek NA immersiyon yağı amacı ile donatılmış bir floresan mikroskop yapılır. Argon / kripton gaz lazer 488 ve 568 nm hatları Rh110C18 ve SRB etiketli virüs heyecanlandırmak için kullanılır. Her etiket eş zamanlı görüntüleme bölme dikroik bir ayna ile yeşil ve kırmızı floresan emisyon tarafından gerçekleştirilir ve görüntüleri bağımsız ayrı bir elektron çarparak CCD kamera yarısı üzerine duruluyor.
Deneyin yapılması
Etiketli virüs parçacıkları, floresein ile yüzey kaplama ve düşük pH tampon (Şekil 1A) ile reaksiyon başlangıcında yerleştirme, füzyon testinin Yürütme akışı hücre içinde biyokimyasal bileşenlerin aşamalı montaj içerir düzlemsel çift katlı lipid montaj: .
- Mikroskop sahneye akış hücre Dağı ve dakikada 40 mikrolitre hızında akış bir şırınga pompa çıkış boru takın.
- HNE 300 mikrolitre akan aşırı lipozomlar akış kanalları temizleyin.
- Mikroskop Focus ve 488 nm ışık ve 568 nm ışık 70 W / cm 2 350 W / cm 2 yüzey aydınlatmak için lazer gücünü ayarlamak. 1.45 NA 60x immersiyon yağı hedefi kullanıyorsanız, sırasıyla, lazer yoğunlukları mikro 100 Watt ve 20 Watt mikro ayarlayabilirsiniz.
- Pompa akış hücresi içine etiketli virüsü (1 / 100 seyreltilmiş). Virüs akış kanalı alt yüzeye yayılır, parçacıklar, çift katlı lipid dahil gangliozid sopa başlayacak.
- Demirledi virüs partikülleri uygun bir yoğunluk (görüş alanı başına yaklaşık 1000 parçacıklar) elde edilmiştir. Mililitre floresein etiketli streptavidin başına iki mikrogram içeren bir çözüm için giriş tüp geçiş yapın. Etiketli streptavidin bilayeri birleştiğinde lipid molekülleri biotin bağlamak ve sonunda loş bir yeşil arka plan görünür olacak.
- Akış kanalı HNE 300 mikrolitre ile yıkayın.
- Bir görüntüleme alanı seçin, mikroskop odak ve CCD kamera zaman lapsed görüntü elde etmek için hazırlar. Pozlama süresi 100 ms ayarlayın ve 10 Hz hızında kare toplamak.
- 10 mM sodyum sitrat ve 140 mM NaCl içeren bir asidik tampon akan füzyon başlatın. Tampon pH test olan virüs kritik pH altında düzenlenmelidir. PH X-31 sigortalar aşağıda 5.5.
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1B füzyon öncesi ve sırasında çift katlı demirledi virionlar anlık gösterir. Her kırınım sınırlı nokta ayrı bir virüs parçacık temsil eder. Kırmızı ve yeşil floresan ayrı viral zarf ve içerik etiketleri eş zamanlı gözlem sağlayan bir CCD kamera, üst ve alt yarısı üzerine imaged edilmiştir. Göre yeşil kanal iki kat daha fazla lekeler genellikle vardırkırmızı, ve bu zarf etikete göre içerik boya ile etiketleme düşük verimlilik yansıtır. Floresein bağlı yüzeyden yayılan yeşil arka plan floresan sitrat tampon vardıklarında kaybolur ve füzyon reaksiyonu başlama zamanını belirliyor. Hemifusion olaylar hemifusion sapı boyunca viral zarf yayılır söndürülür Rh110C18 yeşil floresan patlamaları gibi algılanır ve düzlemsel membran seyreltilir. Dışa doğru genişleyen bir floresan bulut düzlemsel membran yağ açil bağlantılı boya difüzyon gösteren, hemifused parçacıkların çevresinde görülebilir. Gözenek oluşumu viral parçacıkların iç içinde sıkışıp SRB kırmızı floresan çürüme olarak görülmektedir. Bir füzyon gözenek açılması, boya, sulu, gözlem bölgenin düzlemsel bilayeri ve dışarı altında uzaya kaçmak için olanak sağlar.
Floresans şiddeti her parçacık için yörüngeleri, bireysel parçacıkların entegre şiddetleri çizilen hemifusion ve gözenek oluşumu (Şekil 1C) verim ve saatleri belirlenmesi kolaylaştırmak. Hemifusion ve gözenek oluşumu olay kez Rh110C18 floresan patlama veya SRB sinyal çürümesi maksimum eğim oluştuğu noktası olarak belirlenir. Başarılı bir deneyde, Rh110C18 verim dequenching sinyalleri ve SRB etiketli parçacıkların yüzde 30 ile etiketlenmiş parçacıkların yaklaşık yüzde 50 kullanışlı sinyal verir. Iki boya ile işaretlenmiş parçacıklar, yaklaşık yüzde 10, hem de lipid karıştırma ve gözenek oluşumu sinyalleri göstermektedir.
Şekil 2A-C, tipik bir deney hemifusion ve gözenek oluşumu gecikme süreleri dağılım gösterir. Fig.2D-F, aynı koşullar altında yapılan beş deneyler kombine olayların olay dağılımını gösterir. Mütevazı bir gözlem bile, histogramlar şekli açıktır. Her bir deney pH damla zaman algılama ile senkronize olduğundan, birden fazla deneyler kombine edilebilir ve ara adımlar hız sınırlayıcı hakkında ayrıntılı bilgi elde edilebilir.
Şekil 1: Deneysel tasarım . A) Virüs parçacıklar hemifusion ve füzyon gözenek oluşumu kinetiği izlemek için iki floresan boya ile etiketlenir. Floresans yüksek NA mikroskop objektif tarafından toplanan ve bir CCD üzerine görüntülenmiş. B) Floresan görüntüleri (sağda) önce (solda) ve sırasında bireysel viral parçacıkların füzyon. Desteklenen bilayeri aynı ~ 50 x 100 mm 2 'lik alanın her resmin üst ve alt yarısında, sırasıyla, kırmızı ve yeşil floresan karşılık. C) kırmızı SRB viral içerik tracer (üst iz) floresan yoğunluğu, yeşil Rh110C18 membran boya (orta eser) ve pH düşmesi, hemifusion ve füzyon arasında geçen floresein pH sensörü (alt iz) kesin kez sağlar. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Şekil 2 floresan etiketli virüs Fusion kinetiği. PH düşüşü ve hemifusion (A, D) ve gözenek oluşumu (B, E) arasında geçen zaman dağılımları. Dağılımları yükselişi ve çürüme birden fazla ara adımları varlığını göstermektedir. Hemifusion ve bireysel tanecikleri için bir füzyon gözenek açılması arasında geçiş katlanarak hız sınırlayıcı tek bir adım öne dağıtılır. Panelleri AC tek bir deney sonuçları göstermektedir. Aynı koşullar altında yapılan beş ayrı deneylerde Panelleri DF derlenmektedir. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sıvı ve sürekli desteklenen çift katlı lipit katmanını hazırlanması zor olabilir. Malzeme veya yüzey kusurları kirlenmesine neden olan eser miktarda bilayers, yayılmasını önlemek. Dekstran düzgün bir tabaka dikkatli bir temizlik ve birikimi esastır.
Virüs parçacıkları uzun süre görüntüleme floresan etiketleri çamaşır suyu veya inaktif hale gelmesine neden olabilir. Bu tür Foto-hasar ve biyo-görüntüleme ve tek bir molekül alanları bilinir ve genellikle heyecanlı fluorophores reaktif oksijen türlerinin nesilden kaynaklandığı sanılıyor. Foto-hasarı en aza indirmek için, biz genellikle ikaz lazer güç en aza indirmek ve deney başlamadan önce uzun süre maruz kalmasını önlemek. Bildirilen çeşitli oksijen süpürücü sistemleri biriyle tamponlar oksijenin tükenmesi yararlı olabilir.
Geçici ara durumları hakkında bilgi almak için yeteneği füzyon reaksiyonu tam senkronize olmasını gerektirir. Kullanılan akış hızı ve giriş boru ve akış hücresi kanal ölü hacim senkronizasyon sınırı faktörleri vardır. Fusion asidik pH tampon için nötr alışverişi tarafından başlatılır. Ancak asidik tampon akış hücresi içine giriş boru dolaşır gibi, iki tamponlar arasında arayüz difüzyon ile karıştırır ve giderek daha az iyi tanımlanmış olur. Bilayeri yüzeyinde pH degrade başlama saatinin belirlenmesi bulanıklık eğilimindedir. Ayrıca füzyon kinetik proton konsantrasyonu bağlı olduğundan, deney başlangıcında pH degrade sonuçların yorumlanması karmaşık hale getirebilir. Burada gösterilen deney, füzyon kinetiği pH geçiş süresi çok daha yavaş ve degrade etkisi füzyon kinetiği önemli ölçüde etkilemez. Şu anda bize akışı hücre içine akışı aktarmadan önce, istenen tamponu ile giriş boru başbakan olanak sağlayacak değişiklikler akış hücreleri üzerinde çalışıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NIH hibe AI57159 (SCH) ve AI72346 (AMvO) tarafından desteklenmiştir. SCH Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırmacı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Fused silica slides | Technical Glass | ||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | ||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescence microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
