L'esaurimento delle popolazioni di cellule specifiche da deplezione del complemento

Summary

Per studiare in modo efficace la funzione di popolazioni di cellule immunitarie loro purificazione è spesso richiesto. Esaurimento complemento è una tecnica veloce ed economico per l'isolamento di popolazioni di cellule immunitarie con elevata purezza.

Abstract

La purificazione di popolazioni di cellule immunitarie è spesso necessaria per poter studiare le loro funzioni uniche. In particolare, gli approcci molecolari come la PCR in tempo reale e analisi microarray richiedono l'isolamento di popolazioni di cellule con elevata purezza. Strategie di purificazione comunemente usati includono fluorescenti separazione delle cellule attivate (FACS), separazione magnetica tallone e la deplezione del complemento. Delle tre strategie, l'esaurimento complemento offre i vantaggi di essere veloce, poco costoso, delicato sulle cellule e una resa cellula alto. Il sistema del complemento è composto da un gran numero di proteine ​​del plasma che, quando attivato avviare una cascata proteolitica si conclude con la formazione di una membrana attacco complesso che forma un poro sulla superficie cellulare con conseguente morte cellulare

Protocol

A. Coniglio Complemento

1. Coniglio complemento di riserva dovrebbe essere scongelato a temperatura ambiente, e poi aliquotati in 0,5 e / o volumi di 1 ml e congelati a -20-80 ° C per conservazione a lungo termine.
2. Ogni lotto di complemento dovrà essere titolato per determinare la concentrazione ottimale di lavoro. Tipicamente, una diluizione di 1:10-1:20 è ottimale.
3. Complemento di coniglio non è sempre presterilizzati prima della vendita, a seconda dell'uso finale delle celle, il complemento deve essere filtrato sterilizzati quando aliquotati e congelati o prima di essere aggiunti alle cellule.

B. anticorpi selezione

1. Non tutti gli anticorpi sono efficaci in fase di attivazione del complemento, in tal modo gli anticorpi devono essere prima testati per l'attività.
2. Sia topo e nel ratto mAb sono efficaci in fase di attivazione del complemento.
3. Gli anticorpi IgM sono generalmente i più efficienti per l'uso in complemento indotta lisi cellulare seguito da IgG. L'isotipo IgG meglio per l'attivazione del complemento variano tra le specie.
4. Ogni anticorpo deve essere titolato per un uso ottimale delle cellule ad una densità di 10 ⁷ cellule / ml.

C. Protocollo di base

1. Regolare la popolazione cellulare di partenza per 5 x 10 ⁷ cellule / ml in mezzo contenente calore FCS inattivato. Il volume finale delle celle sarà il doppio del volume di partenza. Ricordati di salvare alcune cellule in modo che la riduzione può essere quantificata.
2. Ogni anticorpo deve essere aggiunto alla sospensione cellulare alla concentrazione corretta predeterminato o di diluizione. Mescolare le cellule bene per inversione.
3. Calcolare la quantità di complemento necessario. Scongelare lo stock di complemento a temperatura ambiente. Se il complemento non è sterile, sterilizzare utilizzando un basso legame con le proteine ​​filtro siringa. Alla siringa, aggiungere alcuni millilitri di media prima l'aggiunta del complemento e il filtro direttamente nella provetta contenente le cellule e anticorpi.
4. Regolare il volume finale del tubo in modo che le cellule sono a 1 x 10 ⁷ cellule / ml.
5. Incubare le cellule a 37 ° C per un'ora, mescolando ogni 15 minuti.
6. Centrifugare le cellule ed eliminare il surnatante.
7. Lavare con media due volte. Detriti cellulari che si attacchi al lato di tubi in polistirolo. Le cellule morte e detriti possono essere eliminate con un colino o cellulare per centrifugazione a gradiente di densità.
8. Verificare la purezza delle cellule confrontando la popolazione di cellule prima e dopo l'esaurimento. Citometria a flusso ed immunoistochimica sono due buoni metodi per determinare la purezza delle cellule.

Rappresentante Risultati

Quando si utilizza un anticorpo monoclonale che è altamente efficiente ad attivare complemento, deplezione delle cellule dopo un round è superiore al 95%. Questo è illustrato nella figura 1, dove abbiamo iniziato con splenociti del mouse composti da cellule T αβ 32,2%, come rilevato da espressione di TCRβ (eBioscience, San Diego, CA) in citometria a flusso. Abbiamo esaurito le cellule T utilizzando un mAb specifici per Thy1, una proteina espressa da tutte le cellule T, ma non altri leucociti. L'anticorpo che abbiamo usato era Y-19 di un ratto IgG2c ^2. Seguendo la procedura descritta, la popolazione TCRβ è stata ridotta a 1,56%, una riduzione superiore al 95%.

Figura 1. L'esaurimento delle Thy1 ⁺ cellule T della milza attraverso l'attivazione del complemento. Splenociti del mouse totali sono stati ottenuti dalla omogeneizzazione della milza e lisi dei globuli rossi. Anti-Thy1 e coniglio complemento bambino a concentrazioni predeterminate sono stati aggiunti una sospensione singola cella di splenociti tale che la concentrazione cellulare finale è stato 1 x 10 ⁷ cellule / ml. Dopo l'incubazione per 1 ora a 37 ° C, le cellule sono state lavate due volte e valutate da esclusione trypan blu per la vitalità cellulare. L'efficienza di deplezione è stata valutata mediante citometria di flusso confrontando la percentuale di TCRβ + cellule prima di esaurimento (pannello a sinistra) e dopo l'esaurimento (pannello di destra). La barra orizzontale indica la colorazione positiva e il numero sopra la barra è la percentuale positivo.

Discussion

La purificazione di popolazioni cellulari è una procedura comune richiesto per lo studio delle loro funzioni. Qui si descrive un metodo veloce ed efficace riducono popolazioni di cellule con antigene-anticorpi specifici e l'esaurimento del complemento. L'esaurimento di ogni popolazione di cellule può essere raggiunto se un complemento, l'attivazione di anticorpi è disponibile a un marcatore specifico lignaggio. Qui abbiamo dimostrato l'esaurimento delle cellule T utilizzando un mAb specifici per Thy1, una proteina espressa da tutti essenzialmente popolazioni cellulari T. Noi impoverito oltre il 95% delle cellule T αβ splenociti e le rimanenti sono stati aumentati dal 68% al 98%. Questo livello di purezza cella è simile ad altre strategie di purificazione compresi FACS e magnetici separazione tallone. Esaurimento complemento è una tecnica veloce che può essere eseguita in 1,5 ore una volta che la popolazione cellulare di partenza è ottenuto. Un altro vantaggio di esaurimento complemento è che ogni laboratorio può eseguire la tecnica in quanto non richiede costose attrezzature e reagenti. L'unica elementi principali degli strumenti richiesti sono un bagno d'acqua e una centrifuga. Complemento di coniglio può essere acquistato da una varietà di fornitori a costi ragionevoli (vedi tabella dei reagenti) e molti mAb possono essere acquistati presso ATTC e cresciuto a livello locale per controllare i costi. Al contrario, FACS richiede un citofluorimetro con capacità delle cellule di smistamento che costerà in sei cifre e costoso fluorescente tag mAb. Separazione magnetica tallone è un prezzo abbordabile, ma richiede l'acquisto di un magnete e sfere magnetiche che possono essere costosi. Inoltre, alcune strategie di separazione magnetica tallone richiedono anche l'acquisto di colonne.

Il principale ostacolo per l'utilizzo del complemento per deplezione delle cellule è la disponibilità di complemento attivare mAb con la specificità dell'antigene necessario. Sebbene anticorpi umani, topi e ratti hanno tutti la capacità di fissare complemento, alcuni isotipi sono migliori di altri. Anche se IgM da tutte e tre le specie è altamente efficace a fissare il complemento isotipi IgG variare. Così ogni mAb deve prima essere testato in uno studio pilota per determinare la sua efficacia. Per gli anticorpi che non sono molto efficienti, due turni di esaurimento complemento può essere effettuata senza compromettere la vitalità delle popolazioni di cellule rimanenti. Come un risparmio sui costi, gli anticorpi dovrebbero essere titolati per un'efficacia ottimale. Inoltre, gli anticorpi utilizzati non hanno bisogno di essere purificati. Surnatanti di ibridomi e liquido ascitico lavoro in modo altrettanto efficace, il che è particolarmente conveniente per gli anticorpi IgM, che sono difficili da purificare. Come per gli anticorpi, è indispensabile che il complemento di essere titolati in uno studio pilota. Un troppo elevato di concentrazione comporterà la perdita di vitalità di non mirato popolazioni cellulari. Altrettanto importante è che il tempo di incubazione non superi i 60 minuti.

Nel nostro protocollo, abbiamo co-incubare l'anticorpo e il complemento insieme. Tuttavia, le cellule possono essere etichettati con anticorpi per 15-30 minuti e lavati prima l'aggiunta del complemento. Quando si usa questa strategia, assicurarsi di eseguire le incubazioni anticorpi sul ghiaccio per prevenire la perdita dell'antigene cellule sulla superficie della cellula, come accade con alcune proteine ​​di patch e tappatura o internalizzazione recettoriale. Anche se ad alta efficienza, l'inconveniente principale per completare l'esaurimento rispetto ad altri metodi è che non può essere utilizzato per la selezione positiva. Così è difficile ottenere le sottopopolazioni di cellule. Per esempio, sarebbe difficile per purificare le cellule B della zona marginale a partire da cellule B follicolari, che sarebbe meglio essere fatto da FACS. In questa situazione, l'attivazione del complemento potrebbero essere utilizzati per deplezione delle cellule T per ridurre il numero di celle da ordinare. Questa strategia riduce il tempo per specie, che permetterebbe di risparmiare denaro e sarebbe meno dura sulle cellule.

Dal momento che la purificazione delle popolazioni di cellule specifiche è un requisito comune una serie di strategie sono state sviluppate. I vantaggi principali della strategia di riduzione del complemento sono la sua economicità, semplicità tecnica e risparmio di tempo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-4 week baby rabbit complement	Pel-Freez Biologicals	31061-3
Water bath	Various	various	An incubator set at 37 °C can also be used.