Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

Summary

Para efetivamente estudar a função de populações de células imunes sua purificação é muitas vezes necessária. Esgotamento complemento é uma técnica rápida e barata para o isolamento de populações de células imunes, com alta pureza.

Abstract

A purificação de populações de células imunes é muitas vezes necessária a fim de estudar as suas funções originais. Em particular, as abordagens moleculares, como PCR em tempo real e análise de microarrays requer o isolamento de populações de células com elevado grau de pureza. Estratégias de purificação comumente usados ​​incluem separação de células fluorescentes ativado (FACS), a separação grânulo magnético e esgotamento complemento. Das três estratégias, esgotamento complemento oferece as vantagens de ser rápido, barato, gentil nas células e um rendimento de células de altura. O sistema complemento é composto por um grande número de proteínas plasmáticas que quando ativados iniciam uma cascata proteolítica culminando com a formação de um complexo de ataque à membrana, que forma um poro em uma superfície da célula, resultando em morte celular

Protocol

A. complemento de coelho

1. Complemento de coelho ações devem ser descongeladas em temperatura ambiente, e depois aliquotado em 0,5 e / ou volumes de 1 ml e congelado a -20-80 ° C para armazenamento de longo prazo.
2. Cada lote de complemento deverá ser titulado para determinar a concentração ideal de trabalho. Normalmente, uma diluição de 1:10 - 01:20 é o ideal.
3. Complemento de coelho não é sempre esterilizado antes da venda, dependendo do uso final das células, o complemento deve ser filtrado esterilizado quando aliquotado e congelado ou antes disso para as células.

B. Seleção de anticorpos

1. Nem todos os anticorpos são eficazes na ativação do complemento, os anticorpos, assim, primeiro deve ser testado para a atividade.
2. Ambos os ratos e ratinhos mAb são eficazes na ativação do complemento.
3. Anticorpos IgM são geralmente os mais eficientes para uso em complemento induzida pela lise celular seguido de IgG. Os isotipos IgG melhor para ativação do complemento variam entre as espécies.
4. Cada anticorpo deve ser ajustada para uso otimizado com uma densidade celular de 10 ⁷ células / ml.

C. Básico Protocolo

1. Ajustar a população de células começando a 5 x 10 ⁷ células / ml em meio contendo calor FCS inativado. O volume final das células será o dobro do volume inicial. Lembre-se de salvar algumas células para que o esgotamento pode ser quantificado.
2. Cada anticorpo deve ser adicionada à suspensão celular na concentração adequada predeterminado ou diluição. Misture as células bem por inversão.
3. Calcular o valor do complemento necessário. Descongelar o estoque complementar à temperatura ambiente. Se o complemento não é estéril, esterilizá-lo usando um filtro de baixa proteína de ligação ponta da seringa. Para a seringa, adicione alguns mililitros de meio antes da adição do complemento e filtro diretamente no tubo que contém as células e anticorpos.
4. Ajustar o volume final do tubo de modo que as células estão em 1 x 10 ⁷ células / ml.
5. Incubar as células a 37 ° C por uma hora, misturando a cada 15 minutos.
6. Centrifugar as células e desprezar o sobrenadante.
7. Lavar com média duas vezes. Restos celulares vai ficar para o lado dos tubos de poliestireno. Células mortas e detritos pode ser eliminado usando um coador de celular ou por centrifugação em gradiente de densidade.
8. Verificar a pureza de células, comparando a população de células de interesse, antes e após o esgotamento. Citometria de fluxo e imunohistoquímica são dois bons métodos de determinação da pureza celular.

Resultados representante

Ao usar um mAb que é altamente eficiente em ativar complemento depleção de células, depois de uma rodada é maior do que 95%. Isso é mostrado na Figura 1, onde começamos com esplenócitos do mouse composto de células T αβ 32,2% conforme detectado pela expressão de TCRβ (eBioscience, San Diego, CA) por citometria de fluxo. Nós esgotados células T usando um mAb específicas para Thy1, uma proteína expressa por todas as células T, mas não outros leucócitos. O anticorpo utilizado foi o Y-19 um rato IgG2c ^2. Seguindo o procedimento descrito, a população TCRβ foi reduzida para 1,56%, uma redução superior a 95%.

Figura 1. Depleção de células T ⁺ thy1 esplênica pela ativação do complemento. Esplenócitos do mouse totais foram obtidos pela homogeneização do baço e lise de RBC. Anti-thy1 e complementar bebê coelho em concentrações pré-determinados foram adicionados a uma suspensão única célula de esplenócitos tal que a concentração celular final foi de 1 x 10 ⁷ células / ml. Após a incubação por 1 hora a 37 ° C, as células foram lavadas duas vezes e avaliados pela exclusão de tripan azul para a viabilidade celular. A eficiência da depleção foi avaliada por citometria de fluxo comparando o percentual de TCRβ + células antes de depleção (painel à esquerda) e após a depleção (painel direito). A barra horizontal indica coloração positiva eo número acima da barra é o percentual positivo.

Discussion

A purificação de populações de células é um procedimento comum necessário para o estudo das suas funções. Aqui nós descrevemos um método rápido e eficaz de esgotar populações de células com antígeno de anticorpos específicos e esgotamento complemento. O esgotamento de qualquer população de células pode ser alcançado se um anticorpo ativadores de complemento está disponível para um marcador de linhagem específica. Aqui demonstramos a depleção de células T usando um mAb específicas para Thy1, uma proteína expressa essencialmente por todas as populações de células T. Nós esgotado mais de 95% das células T αβ e os restantes esplenócitos foram aumentados de 68% para 98%. Este nível de pureza das células é semelhante a outras estratégias de purificação e separação incluindo FACS grânulo magnético. Esgotamento complemento é uma técnica rápida que pode ser realizado em 1,5 horas, uma vez a população de células de partida é obtida. Outra vantagem do esgotamento complemento é que qualquer laboratório pode realizar a técnica, pois não requer equipamento caro e reagentes. As únicas peças principais do equipamento necessário é um banho de água e uma centrífuga. Complemento de coelho pode ser comprado de uma variedade de fornecedores a um custo razoável (ver tabela de reagentes) e mAb muitos pode ser comprado de ATTC e cultivado localmente para controlar custos. Em contraste, FACS requer um citômetro de fluxo com capacidade de separação de células que vai custar nos seis números e caro mAb fluorescente etiquetado. Separação grânulo magnético está com preços moderados, mas requer a compra de um ímã e esferas magnéticas, que podem ser caros. Além disso, algumas estratégias de separação magnética talão também exigem a compra de colunas.

O principal obstáculo para o uso de complemento para depleção de células é a disponibilidade de complemento ativando mAb com a especificidade de antígeno necessária. Embora os anticorpos do rato humano, e todos os ratos têm a capacidade de fixar o complemento, alguns isotipos são melhores que outros. Apesar de IgM de todas as três espécies é altamente eficaz na fixação complementar o isotipos IgG variar. Assim, cada mAb deve primeiro ser testada em um estudo piloto para determinar a sua eficácia. Para anticorpos que não são altamente eficientes, duas rodadas de esgotamento complementar pode ser realizada sem afetar a viabilidade das populações de células remanescentes. Como uma economia de custos, os anticorpos devem ser ajustadas para uma eficácia óptima. Além disso, os anticorpos utilizados não precisa ser purificado. Sobrenadantes hibridoma e ascite trabalho fluido tão eficazmente, que é particularmente conveniente para anticorpos IgM, que são difíceis de purificar. Tal como acontece com os anticorpos, é imperativo que o complemento ser titulada em um estudo piloto. Um muito alto de concentração resultará na perda da viabilidade das populações não-alvo celular. Também importante é que o tempo de incubação não exceda 60 minutos.

Em nosso protocolo, que co-incubação do anticorpo e do complemento juntos. No entanto, as células podem ser rotulados com anticorpos para 15-30 minutos e lavado antes da adição do complemento. Ao usar esta estratégia, certifique-se de realizar a incubação de anticorpos no gelo para evitar a perda do antígeno de células na superfície da célula, como ocorre com algumas proteínas por patching e nivelamento ou internalização do receptor. Apesar de altamente eficiente, a principal desvantagem para complementar o esgotamento, em comparação com outros métodos é que ele não pode ser usado para a seleção positiva. Assim, é difícil obter subpopulações de células. Por exemplo, seria difícil para purificar as células B de zona marginal de células B folicular, o que seria melhor ser feito por FACS. Nesta situação, a ativação do complemento pode ser usado para retirada de células T para reduzir o número de células que estão sendo classificados. Esta estratégia seria reduzir o tempo de classificação, o que economizar dinheiro e seria menos severo nas células.

Desde a purificação de populações de células específicas é um requisito comum uma série de estratégias têm sido desenvolvidas. As principais vantagens da estratégia de esgotamento complemento estão a sua acessibilidade, simplicidade técnica e economia de tempo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-4 week baby rabbit complement	Pel-Freez Biologicals	31061-3
Water bath	Various	various	An incubator set at 37 °C can also be used.