Uitputting van specifieke celpopulaties door Complement Uitputting

Summary

Om effectief onderzoek naar de werking van het immuunsysteem celpopulaties hun zuivering vaak vereist is. Complement uitputting is een snelle en goedkope techniek voor de isolatie van het immuunsysteem van celpopulaties met hoge zuiverheid.

Abstract

De zuivering van het immuunsysteem celpopulaties is vaak nodig om hun unieke functies te bestuderen. In het bijzonder de moleculaire benaderingen, zoals real-time PCR en microarray analyse vereisen de isolatie van celpopulaties met hoge zuiverheid. Veelgebruikte zuivering strategieën omvatten fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), magnetische bead scheiding en een aanvulling uitputting. Van de drie strategieën, een aanvulling op uitputting biedt de voordelen van snel, goedkoop, zacht voor de cellen en een hoge cel opbrengst. Het complement systeem is samengesteld uit een groot aantal plasma-eiwitten die indien geactiveerd het initiëren een proteolytische cascade culminerend in de vorming van een membraan-attack complex dat een porie op een celoppervlak resulteert in celdood vormen

Protocol

A. Konijn Complement

1. Stock konijnencomplement moet worden ontdooid bij kamertemperatuur en daarna in hoeveelheden verdeeld in 0,5 en / of hoeveelheden van 1 ml en ingevroren bij -20 tot 80 ° C voor opslag op lange termijn.
2. Elke partij van complement moet worden getitreerd tot de optimale werking concentratie te bepalen. Typisch, een verdunning van 1:10-1:20 is optimaal.
3. Konijnencomplement is niet altijd vóór de verkoop presterilized, afhankelijk van de uiteindelijke gebruik van de cellen, moet het complement worden gefilterd gesteriliseerd bij hoeveelheden verdeeld en bevroren of voorafgaand aan aanvulling op de cellen.

B. Antilichaam Selectie

1. Niet alle antilichamen zijn effectief in het complement activatie, dus de antistoffen voor het eerst moeten worden getest op activiteit.
2. Zowel de muis en rat mAb zijn effectief in het complement activatie.
3. IgM antistoffen zijn over het algemeen het meest efficiënt voor gebruik in complement-geïnduceerde cel lysis, gevolgd door IgG. De IgG isotypen beste voor complement activatie variëren tussen soorten.
4. Elk antilichaam moet worden getitreerd voor optimaal gebruik in een cel dichtheid van 10 ⁷ cellen / ml.

C. Basis Protocol

1. Stel het startpunt celpopulatie tot 5 x 10 ⁷ cellen / ml in medium dat warmte geïnactiveerd FCS. Het uiteindelijke volume van de cellen twee keer het uitgangspunt volume. Vergeet niet om enkele cellen op te slaan, zodat de uitputting kunnen worden gekwantificeerd.
2. Elk antilichaam moet worden toegevoegd aan de celsuspensie op de juiste vooraf bepaalde concentratie of verdunning. Meng de cellen goed door inversie.
3. Bereken de hoeveelheid van complement nodig. Ontdooi het complement voorraad bij kamertemperatuur. Als de aanvulling is niet steriel, steriliseren met behulp van een lage eiwitbinding spuit tip filter. Aan de injectiespuit, voorafgaand Voeg enkele milliliters medium om de toevoeging van de aan te vullen en filter direct in de buis die de cellen en antistoffen.
4. Pas het laatste deel in de buis, zodat de cellen zijn op 1 x 10 ⁷ cellen / ml.
5. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende een uur, mengen om de 15 minuten.
6. Centrifugeer de cellen en gooi het supernatant.
7. Wassen met medium tweemaal. Celresten blijft plakken aan de zijkant van polystyreen buizen. Dode cellen en vuil kan worden verwijderd met behulp van een cel zeef of door de dichtheid gradiënt centrifugatie.
8. Controleer de cel zuiverheid door het vergelijken van de cel bevolking van belang voor en na uitputting. Flowcytometrie en immunohistochemie zijn twee goede methoden voor het bepalen cel zuiverheid.

Representatieve resultaten

Bij gebruik van een mAb, dat is zeer efficiënt bij het activeren van complement, cel depletie na een ronde is groter dan 95%. Dit wordt weergegeven in figuur 1, waar we begonnen met de muis splenocyten bestaat uit 32,2% αβ T-cellen zoals gedetecteerd door expressie van TCRβ (eBioscience, San Diego, CA) door flowcytometrie. We uitgeput T-cellen met behulp van een mAb specifiek voor Thy1, een proteïne die door alle T-cellen, maar geen andere leukocyten. Het antilichaam we gebruikten was Y-19 een rat IgG2c ^2. Naar aanleiding van de beschreven procedure, werd de TCRβ bevolking teruggebracht tot 1,56%, een meer dan 95% korting.

Figuur 1. Uitputting van thy1 ⁺ milt T-cellen door complement activatie. Total muis splenocyten werden verkregen door homogenisatie van de milt en lysis van RBC. Anti-thy1 en baby konijn aanvulling op vooraf bepaalde concentraties werden toegevoegd aan een enkele celsuspensie van splenocyten zodanig dat de laatste cel concentratie was 1 x 10 ⁷ cellen / ml. Na incubatie gedurende 1 uur bij 37 ° C werden de cellen tweemaal gewassen en geëvalueerd door trypan blauw uitsluiting voor de levensvatbaarheid van de cellen. De efficiëntie van uitputting werd beoordeeld door flowcytometrie vergelijken van het percentage TCRβ + cellen voor uitputting (linker paneel) en na uitputting (rechter paneel). De horizontale balk geeft positieve kleuring en het nummer boven de bar is het percentage positief.

Discussion

De zuivering van celpopulaties is een gemeenschappelijke procedure vereist is voor de studie van hun functies. Hier beschrijven we een snelle en effectieve methode van uitputting van celpopulaties met behulp van antigeen-specifieke antilichamen en complement uitputting. De uitputting van een cel bevolking kan worden bereikt als een complement-activerende antilichaam beschikbaar is voor een lineage specifieke marker. Hier hebben we de uitputting van de T-cellen met behulp van een mAb specifiek voor Thy1 aangetoond, een eiwit uitgedrukt in wezen alle T-cel populaties. We uitgeput dan 95% van αβ T-cellen en de resterende splenocyten werden verhoogd van 68% tot 98%. Dit niveau van cel zuiverheid is vergelijkbaar met andere strategieën, inclusief de zuivering FACS en magnetische kraal scheiding. Complement uitputting is een snelle techniek die kan worden uitgevoerd in 1,5 uur na de start celpopulatie wordt verkregen. Een ander voordeel van complement uitputting is dat elk laboratorium kan de techniek uit te voeren, omdat het niet nodig dure apparatuur en reagentia. De enige belangrijke onderdelen van de apparatuur die nodig is zijn een waterbad en een centrifuge. Konijnencomplement kunnen worden gekocht bij verschillende leveranciers tegen een redelijke kostprijs (zie de tabel van de reagentia) en vele mAb kunnen worden gekocht bij ATTC en lokaal geteeld om de kosten te beheersen. In tegenstelling, FACS is een flowcytometer met mobiele sorteercapaciteit dat kost in de zes cijfers en dure fluorescent gelabelde mAb. Magnetische kraal scheiding is redelijk geprijsd, maar vereist de aanschaf van een magneet en magnetische kralen, die kan kostbaar zijn. Bovendien hebben sommige magnetische kraal scheiding strategieën vereisen ook de aankoop van kolommen.

Het voornaamste struikelblok voor het gebruik van de aanvulling voor celdepletie is de beschikbaarheid van complement activeren mAb met de nodige antigen specificiteit. Hoewel de mens, muis en rat-antilichamen hebben allemaal de capaciteit om complement te repareren, sommige isotypen zijn beter dan anderen. Hoewel IgM van alle drie de soorten is zeer effectief bij de vaststelling een aanvulling op de IgG-isotypes variëren. Dus elke mAb moet eerst worden getest in een pilot-studie om de doeltreffendheid ervan bepalen. Voor antilichamen die niet zeer efficiënt, kunnen twee rondes van complement uitputting worden uitgevoerd zonder dat de levensvatbaarheid van de resterende celpopulaties. Als een kostenbesparing, moet de antilichamen worden getitreerd voor een optimale effectiviteit. Daarnaast, doe de gebruikte antilichamen niet te worden gezuiverd. Hybridoma supernatants en ascites vloeistof werken net zo effectief, wat vooral handig is voor IgM-antilichamen, die moeilijk te zuiveren. Net als bij de antilichamen, is het noodzakelijk dat het complement worden getitreerd in een pilot-studie. Een te hoge concentratie zal resulteren in verlies van de levensvatbaarheid van niet-gerichte celpopulaties. Ook belangrijk is dat de incubatie tijd niet meer dan 60 minuten.

In ons protocol, we samen co-incubeer het antilichaam en het complement. Echter, kunnen de cellen gelabeld worden met antilichamen voor 15-30 minuten en gewassen voorafgaand aan de toevoeging van complement. Bij het gebruik van deze strategie, zorg ervoor dat het antilichaam incubaties uit te voeren op het ijs om het verlies van de cel-antigeen op het celoppervlak te voorkomen, zoals gebeurt met sommige eiwitten met een patch en de aftopping of receptor internalisatie. Hoewel zeer efficiënt, het belangrijkste nadeel van uitputting te vullen ten opzichte van andere methoden is dat het niet kan worden gebruikt voor positieve selectie. Zo is het moeilijk te verkrijgen subpopulaties van cellen. Bijvoorbeeld, zou het moeilijk zijn om marginale zone B cellen van folliculair B-cellen, die het best zou worden gedaan door FACS te zuiveren. In deze situatie kan complement activatie worden gebruikt om de T-cellen te verminderen tot het aantal cellen worden gesorteerd te verminderen. Deze strategie zou de soort tijd, dat zou geld te besparen en zou minder hard op de cellen.

Omdat de zuivering van specifieke celpopulaties is een veel voorkomende eis van een aantal strategieën ontwikkeld. De belangrijkste voordelen van het complement uitputting strategie zijn de betaalbaarheid, technische eenvoud en tijdsbesparing.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-4 week baby rabbit complement	Pel-Freez Biologicals	31061-3
Water bath	Various	various	An incubator set at 37 °C can also be used.