प्रभावी ढंग से उनकी शुद्धि अक्सर आवश्यक है प्रतिरक्षा सेल आबादी के समारोह का अध्ययन. पूरक रिक्तीकरण उच्च शुद्धता के साथ प्रतिरक्षा सेल आबादी के अलगाव के लिए एक तेजी से और सस्ती तकनीक है.
प्रतिरक्षा सेल आबादी की शुद्धि अक्सर क्रम में उनके अद्वितीय कार्य का अध्ययन आवश्यक है. वास्तविक समय पीसीआर और माइक्रोएरे विश्लेषण के रूप में विशेष रूप से, आणविक दृष्टिकोण में उच्च शुद्धता के साथ सेल आबादियों के अलगाव की आवश्यकता है. आमतौर पर इस्तेमाल किया शुद्धि रणनीतियों फ्लोरोसेंट सक्रिय कक्ष (FACS) छँटाई, चुंबकीय मनका जुदाई और पूरक रिक्तीकरण शामिल हैं. तीन रणनीतियों, पूरक कमी तेज, सस्ती, कोशिकाओं और एक उच्च सेल उपज पर कोमल होने का लाभ प्रदान करता है है. पूरक प्रणाली प्लाज्मा प्रोटीन की एक बड़ी संख्या है कि जब सक्रिय एक proteolytic एक झिल्ली हमले जटिल है कि कोशिका मृत्यु में जिसके परिणामस्वरूप एक सेल की सतह पर एक ताकना रूपों के गठन में समापन झरना आरंभ से बना है<sup> 1</sup>. शास्त्रीय मार्ग आईजीएम और आईजीजी से सक्रिय है और पहली बार बैक्टीरिया की हत्या के लिए एक तंत्र के रूप में वर्णित किया गया था. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MAB) की पीढ़ी के साथ, पूरक झरना एक प्रतिजन विशिष्ट तरीके में किसी भी सेल की आबादी lyse करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पूरक झरना द्वारा कोशिकाओं के रिक्तीकरण पूरक फिक्सिंग प्रतिजन विशिष्ट एंटीबॉडी और खरगोश शुरू सेल की आबादी के लिए पूरक के अलावा द्वारा हासिल की है. कोशिकाओं को एक घंटे के लिए 37 में incubated हैं डिग्री सेल्सियस और lysed कोशिकाओं बाद धोने के दो राउंड के द्वारा हटा दिया जाता है. MAB पूरक निर्धारण के लिए एक उच्च दक्षता के साथ आमतौर पर लक्षित सेल की आबादी का 95-100% चूस लेना. लक्षित सेल की आबादी के लिए शुद्धीकरण की रणनीति पर निर्भर करता है, पूरक रिक्तीकरण सेल शुद्धि के लिए या सेल आबादी है कि तब और बाद में एक विधि द्वारा शुद्ध किया जा सकता है के संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
सेल आबादी की शुद्धि एक आम उनके कार्यों के अध्ययन के लिए आवश्यक प्रक्रिया है. यहाँ हम कोशिका प्रतिजन विशिष्ट एंटीबॉडी और पूरक रिक्तीकरण का उपयोग आबादी घट की एक तेजी से और प्रभावी विधि का वर्णन. किसी भी सेल की आबादी की कमी अगर एक पूरक सक्रिय प्रतिरक्षी एक वंश विशिष्ट मार्कर के लिए उपलब्ध है हासिल किया जा सकता है. यहाँ हम टी Thy1 के लिए एक MAB विशिष्ट का उपयोग कोशिकाओं की कमी का प्रदर्शन किया, एक प्रोटीन अनिवार्य रूप से सभी टी सेल आबादी के द्वारा व्यक्त की है. हम αβ टी कोशिकाओं के 95% से अधिक समाप्त हो गया और शेष splenocytes 68% से 98% के लिए बढ़ रहे थे. सेल पवित्रता का यह स्तर FACS और चुंबकीय मनका जुदाई सहित अन्य शुद्धि रणनीतियों के लिए इसी तरह की है. पूरक रिक्तीकरण एक तेजी से तकनीक है कि 1.5 घंटे में किया जा सकता है एक बार शुरू सेल की आबादी प्राप्त की है. पूरक कमी की एक और लाभ यह है कि किसी भी प्रयोगशाला तकनीक का प्रदर्शन क्योंकि यह महंगे उपकरण और अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है सकते हैं. केवल उपकरणों के प्रमुख टुकड़े की आवश्यकता एक पानी स्नान और एक अपकेंद्रित्र हैं. खरगोश पूरक विक्रेताओं की एक किस्म से एक उचित कीमत पर खरीदा जा सकता है (अभिकर्मकों की तालिका देखें) और कई MAB ATTC से खरीदा जा सकता है और स्थानीय बढ़ी लागत नियंत्रण. इसके विपरीत, FACS सेल छँटाई की क्षमता के साथ एक प्रवाह cytometer कि छह आंकड़े और महंगी fluorescently टैग MAB में खर्च होंगे की आवश्यकता है. चुंबकीय मनका जुदाई मामूली कीमत है, लेकिन एक चुंबक और चुंबकीय मोती, जो महंगा हो सकता है की खरीद की आवश्यकता है. इसके अलावा, कुछ चुंबकीय मनका जुदाई रणनीतियों भी स्तंभों की खरीद की आवश्यकता होती है.
सेल रिक्तीकरण के लिए पूरक का उपयोग करने के लिए मुख्य बाधा प्रतिजन आवश्यक विशिष्टता के साथ MAB सक्रिय पूरक की उपलब्धता है. हालांकि मानव, माउस, चूहा और एंटीबॉडी सभी के लिए पूरक तय करने की क्षमता है, कुछ isotypes दूसरों की तुलना में बेहतर हैं. हालांकि सभी तीन प्रजातियों से आईजीएम पूरक फिक्सिंग पर अत्यधिक प्रभावी है आईजीजी isotypes बदलती हैं. इस प्रकार हर MAB पहले एक पायलट अध्ययन में परीक्षण किया जाना चाहिए है उसकी प्रभावशीलता निर्धारित करने के लिए. एंटीबॉडी कि अत्यधिक कुशल नहीं हैं के लिए, पूरक कमी की दो राउंड शेष सेल आबादी की व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना किया जा सकता है. एक लागत बचत के रूप में, एंटीबॉडी इष्टतम प्रभावशीलता के लिए titrated होना चाहिए. इसके अलावा, इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए शुद्ध होने की जरूरत नहीं है. हाइब्रिडोमा supernatants और जलोदर द्रव काम बस के रूप में प्रभावी ढंग से, जो आईजीएम एंटीबॉडी, जो शुद्ध मुश्किल कर रहे हैं के लिए विशेष रूप से सुविधाजनक है. एंटीबॉडी के साथ के रूप में, यह आवश्यक है कि पूरक एक पायलट अध्ययन में titrated हो. एकाग्रता की एक बहुत अधिक गैर – लक्षित सेल आबादी की व्यवहार्यता के नुकसान में परिणाम देगा. यह भी महत्वपूर्ण है कि ऊष्मायन समय 60 मिनट से अधिक नहीं करता है.
हमारे प्रोटोकॉल में, हम एंटीबॉडी और पूरक के साथ सह सेते हैं. हालांकि, कोशिकाओं 15-30 मिनट के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जा सकता है और पूरक के अलावा पहले धोए. जब इस रणनीति का प्रयोग, कोशिका की सतह पर कोशिका प्रतिजन की हानि को रोकने के लिए बर्फ पर एंटीबॉडी incubations प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करें, के रूप में पट्टी और कैपिंग या रिसेप्टर internalization द्वारा कुछ प्रोटीन के साथ होता है. हालांकि, अत्यधिक कुशल रिक्तीकरण पूरक के रूप में अन्य विधियों की तुलना में मुख्य दोष यह है कि यह सकारात्मक चयन के लिए नहीं किया जा सकता है. इस प्रकार यह मुश्किल है के लिए कक्षों की subpopulations प्राप्त. उदाहरण के लिए, यह मुश्किल हो सकता है के कूपिक बी कोशिकाओं है, जो सबसे अच्छा FACS द्वारा किया जाएगा से सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं को शुद्ध होता है. इस स्थिति में, सक्रियण पूरक टी कोशिकाओं व्यय जा रहा सॉर्ट किया गया कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस रणनीति तरह समय को कम, जो पैसे बचाने के लिए होगा और कोशिकाओं पर कम कठोर हो जाएगा.
विशेष सेल आबादी की शुद्धि के बाद एक आम आवश्यकता है रणनीतियों का एक संख्या में विकसित किया गया है. पूरक रिक्तीकरण रणनीति का मुख्य लाभ अपनी सामर्थ्य, तकनीकी सादगी और समय की बचत कर रहे हैं.
मैं Sreemanti बसु चित्रा 1 के लिए डेटा प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के हिस्से में NIH अनुदान AI069358 और BloodCenter रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |