Summary
Die Bauchhöhle bei Säugetieren enthält verschiedene Immunzellen Bevölkerung entscheidend für angeborenen Immunantwort. Eine effiziente Isolierung Methode ist für biochemische und funktionelle Analyse dieser Zellen erforderlich ist. Hier bieten wir eine umfassende Methode zur Isolierung von Bauchhöhle Zellen in der Maus.
Abstract
Die Bauchhöhle ist eine Membran-gebundene und mit Flüssigkeit gefüllte Bauchhöhle von Säugetieren, die die Leber, die Milz, die meisten von den Magen-Darm-Trakt und anderen Innereien enthält. Es birgt eine Reihe von Immunzellen einschließlich Makrophagen, B-Zellen und T-Zellen. Die Anwesenheit einer großen Zahl von naiven Makrophagen in die Bauchhöhle macht es zu einem bevorzugten Standort für die Sammlung von naiven Gewebe Makrophagen (1). Die Bauchhöhle ist auch wichtig, die Studie von B-Zellen durch die Anwesenheit eines einzigartigen Bauchhöhle ansässige B-Zell-Untergruppe als B1-Zellen zusätzlich zur konventionellen B2-Zellen bekannt. B1-Zellen werden in B1a und B1b-Zellen, die durch die Oberflächenexpression von CD11b und CD5 unterschieden werden können unterteilt. B1-Zellen sind eine wichtige Quelle der natürlichen IgM frühzeitige Schutz vor einer Vielzahl von Erregern (2-4). Diese Zellen sind autoreaktive in der Natur (5), sondern wie sie kontrolliert werden, um Autoimmunität zu verhindern, ist noch nicht vollständig verstanden. Im Gegenteil, CD5
Protocol
- Vor Beginn des Prozesses, müssen die folgenden Punkte zu sein, gesammelt und aufbereitet:
- Eis
- 5ml Spritze mit 27g Nadel
- 5ml Spritze mit 25G-Nadel
- Styropor-Block und Stifte für die Montage der Maus
- Tablett, auf dem der Montageblock platziert werden können
- Schere und Pinzette
- Sammelröhrchen
- 70% Ethanol
- PBS mit 3% fötalem Kälberserum (FCS) (Pre gekühlt und auf Eis gehalten)
- Euthanize der Maus, sprühen sie mit 70% Ethanol und montieren Sie ihn auf den Styropor-Block auf den Rücken.
- Mit einer Schere und Pinzette schneiden die Außenhaut des Bauchfells und ziehen Sie es vorsichtig zurück in die Innenhaut Auskleidung der Bauchhöhle aussetzen.
- Inject 5 ml eiskaltem PBS (mit 3% FCS) in die Bauchhöhle mit einer 27g Nadel. Drücken Sie die Nadel langsam in das Bauchfell man aufpassen, nicht zu durchstechen alle Organe.
- Nach der Injektion sanft massieren das Bauchfell an alle angeschlossenen Zellen in der PBS-Lösung zu entfernen.
- Legen Sie eine 25 g Nadel-, Kegel auf, an einer 5 ml Spritze in das Bauchfell und sammeln die Flüssigkeit während der Bewegung die Spitze der Nadel vorsichtig, um ein Verstopfen durch das Fettgewebe oder anderen Organen. Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und Einzahlung der gesammelten Zellsuspension in Röhrchen auf Eis nach dem Entfernen der Nadel von der Spritze gehalten.
Optional: Wiederholen Sie Schritt 4-6 - Machen Sie einen Schnitt in der inneren Haut des Bauchfells und während hält die Haut mit einer Pinzette einen Kunststoff Pasteurpipette auf die verbleibenden Flüssigkeit aus dem Hohlraum sammeln.
- Wenn in Schritt 6 oder 7 sichtbaren Kontamination mit Blut festgestellt wird dann das verunreinigte Probe zu verwerfen.
- Spin der gesammelten Zellsuspension bei 1500 RPM für 8 Minuten, den Überstand verwerfen und Zellen in das gewünschte Medium oder PBS für das Zählen.
Alternative Protokoll Thioglycolat erhalten hervorgerufen Makrophagen:
Diese Methode wird verwendet, um eine höhere Ausbeute an Makrophagen zu erhalten.
- Inject 5 ml 3% (w / v) Brewer Thioglycolat Medium (7) in die Bauchhöhle von jeder Maus.
- Warten Sie 3-5 Tage und fahren bis 1 oben für die Entnahme der Zellen Schritt.
Im Vergleich zu den nonelicited Ansatz können etwa 10 mal mehr Makrophagen gesammelt werden. Die einzige Sorge ist, dass Makrophagen durch dieses Verfahren erhalten in einigen ihrer physiologischen Eigenschaften unterscheiden.
Repräsentative Ergebnisse:
Von einem unmanipulierten Maus können 5 bis 10.000.000 Bauchhöhle Zellen mit einer guten Isolierung Protokoll erreicht werden. Unter allen lebenden Zellen, 50-60% B-Zellen sind, sind ca. 30% Makrophagen und 5-10% T-Zellen (Abb. 1).
Abbildung 1. Phänotyp von Zellen aus der Bauchhöhle getrennt. Nach der Isolierung der Bauchhöhle Zellen wurden mit anti-Maus-FITC TCRβ, B220-PE-Texas-Rot, CD11b-Pazifik blau, CD23-PE-Cy7 und CD5-APC. Vertreter durchflusszytometrischen Plots zeigen Prozentsätze der B-und T-Zellen (a), Makrophagen (b), B1 und B2-Zellen (c) und B1a und B1b-Zellen (d).
Discussion
Isolation der Bauchhöhle Zellen ist eine wichtige Technik für die Untersuchung von verschiedenen Immunzellen, vor allem Makrophagen und spezifische B-Zell-Subpopulationen. Obwohl dies ein einfacher Vorgang, es gibt einige wichtige Schritte beteiligt. Vorhandensein von kontaminierenden Blut in den gesammelten Proben sollte vermieden werden, um eine reine Bauchhöhle Zellpopulation zu erhalten. Euthanasie durch Genickbruch sollte sorgfältig durchgeführt werden, um Kontamination mit Blut in der Bauchhöhle zu vermeiden. Alternativ CO 2 eingesetzt werden kann. Darüber hinaus sollte im Laufe des Verfahrens die richtige Pflege genommen, um zu vermeiden Punktion der Blase oder anderer Organe in der Bauchhöhle werden. Wiederherstellen meisten der injizierten Flüssigkeit ist auch wichtig, um die Zelle zu erhalten.
Dieses Verfahren ist weit verbreitet, um Makrophagen Biologie seit moderate Zahl der Einwohner studieren, können nicht stimulierten Makrophagen leicht aus der Bauchhöhle gewonnen werden, im Gegensatz zu den mühsamen Aufgabe der Differenzierung myeloischer Vorläuferzellen zu reifen Makrophagen in vitro mit Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (8 , 9). Die Makrophagen-Ausbeute aus der Bauchhöhle kann durch die Verwendung der Thioglycolat Erhebung Methode verbessert werden, obwohl Thioglycolat Nutzung physiologischen Eigenschaften der Makrophagen (7) verändern könnten.
B-Zellen sind ein wichtiger Teil unseres Immunsystems spielen eine entscheidende Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunität. Unter den verschiedenen B-Zell-Subpopulationen umfassen B1-Zellen eine einzigartige Subpopulation von B-Zellen in der angeborenen Immunität, Autoimmunität und Immunregulation beteiligt. B1-Zellen sind in erster Linie in der Bauchhöhle und sind selbst Nachfüllen. Sie sind einer der wichtigsten Produzenten von natürlichen IgM, die die erste Verteidigungslinie gegen eine Reihe von Viren und Bakterien (10-12) zur Verfügung stellt. B1-Zellen sind auch eine wichtige Quelle von IL-10 (6), die eine wichtige Zytokin in der Immunregulation beteiligt ist. Obwohl mehrere Studien mit dem B1-Zellen ausgeübt worden sein, noch gibt es Spielraum für die weitere Auswertung ihrer gegensätzlichen Funktionen, die speziell ihre regulatorische Rolle. Bauchhöhle Zellisolation Methode bietet die einzigartige Möglichkeit, die Funktionen des B1-Zellen zu studieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH AI069358 und die BloodCenter Research Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD Biosciences | 211716 |
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