Summary
חלל הצפק ביונקים מכילה אוכלוסיות תאים שונות החיסונית חיוני תגובות חיסוניות מולדות. שיטת בידוד יעיל נדרש ניתוח ביוכימי ותפקודי של תאים אלה. כאן אנו מספקים שיטה מקיפה עבור בידוד של תאים חלל הצפק בתוך העכבר.
Abstract
חלל הצפק הוא קרום חלל הבטן, כפות מלאות נוזל של יונקים, אשר מכיל את הכבד, הטחול, רוב דרכי העיכול ואת הקרביים האחרים. זה מכיל מספר תאים חיסוניים כולל מקרופאגים, תאים B ותאי T. נוכחות מספר גבוה של מקרופאגים נאיבי חלל הצפק שהופך אותו לאתר מועדף לאיסוף נאיבי תושב מקרופאגים ברקמה (1). חלל הצפק חשוב גם במחקר בתאי B בגלל נוכחות של תת קבוצה ייחודית חלל הצפק תושב B לתא המכונה התאים B1 בנוסף התאים B2 קונבנציונאלי. בתאים B1 מחולקים לתאים B1a ו B1b, אשר יכול להיות מכובדת על ידי ביטוי את פני השטח של CD11b ו CD5. בתאים B1 הם מקור חשוב של IgM טבעי מתן הגנה מוקדם ממגוון רחב של פתוגנים (2-4). תאים אלה הם autoreactive בטבע (5), אבל איך הם נשלטים על מנת למנוע אוטואימוניות עדיין אינה מובנת לחלוטין. להיפך, CD5
Protocol
- לפני שמתחילים את התהליך, את הפריטים הבאים צריכים להיות מוכנים אסף:
- קרח
- מזרק 5 מ"ל עם מחט 27g
- מזרק 5 מ"ל עם מחט 25 גרם
- בלוק קלקר וסיכות להרכבה על העכבר
- מגש שעליו לחסום הרכבה ניתן למקם
- מספריים ומלקחיים
- אוסף צינורות
- 70% אתנול
- PBS עם 3% עגל בסרום עוברי (FCS) (Pre צונן ושמרה על הקרח)
- להרדים את העכבר, לרסס אותו עם 70% אתנול ו לעלות אותו על בלוק קלקר על גבו.
- בעזרת מספריים מלקחיים לחתוך את העור החיצונית של הצפק בעדינות למשוך אותו לאחור כדי לחשוף את העור הפנימית רירית חלל הצפק.
- הזרק 5 מ"ל של קרח קר PBS (עם FCS 3%) לתוך חלל הצפק באמצעות מחט 27g. דחוף את המחט לאט הצפק נזהרים שלא לנקב כל האיברים.
- לאחר ההזרקה, בעדינות לעסות את הצפק כדי לסלק את כל התאים מחוברים אל הפתרון PBS.
- הוסף 25 גרם, שפוע המחט, מצורף מזרק 5 מ"ל ב הצפק לאסוף את הנוזל תוך כדי תנועה את קצה המחט בעדינות, כדי למנוע סתימת על ידי רקמת שומן או איברים אחרים. כמו איסוף הנוזלים כמה שניתן להפקיד את ההשעיה תא שנאספו צינורות שמרה על הקרח לאחר הסרת המחט של המזרק.
אופציונלי: חזור על שלב 4-6 - עושים חתך בעור הפנימי של הצפק ובעוד מרים את העור עם מלקחיים להשתמש פיפטה פסטר מפלסטיק כדי לאסוף את הנוזלים הנותרים מחלל.
- אם בשלב 6 או 7 זיהום דם גלוי מזוהה אז המדגם מזוהמים צריך להיות מושלך.
- ספין על השעיית התא נאספים 1500 סל"ד במשך 8 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend התאים התקשורת הרצוי או PBS עבור הספירה.
פרוטוקול אלטרנטיבית להשיג thioglycollate שהושרו מקרופאגים:
שיטה זו משמשת כדי להשיג תשואה גבוהה יותר של מקרופאגים.
- הזרק 5 מ"ל של 3% (w / v) ברואר thioglycollate בינוני (7) לתוך חלל הצפק של עכבר אחד.
- המתן 3-5 ימים, המשך לשלב 1 לעיל לאיסוף של התאים.
לעומת הגישה nonelicited, כ 10 פעמים יותר מקרופאגים ניתן לאסוף. החשש היחיד הוא מתקבל על ידי מקרופאגים הליך זה שונה בכמה מאפיינים פיזיולוגיים שלהם.
נציג התוצאות:
מתוך עכבר unmanipulated, 5-10000000 התאים חלל הצפק ניתן להשיג עם פרוטוקול בידוד טוב. בין כל תאים חיים, 50-60% הם תאים B, מקרופאגים ~ 30% ו 5-10% הם תאים T (איור 1).
באיור 1. הפנוטיפ של תאים בודדים מתוך חלל הצפק. הבידוד בעקבות התאים חלל הצפק הם הוכתמו עכבר אנטי TCRβ-FITC, B220-PE-טקסס אדום, כחול פסיפיק CD11b, CD23-PE-Cy7 CD5 ו-APC. מגרשים תזרים נציג cytometric להראות אחוזים של תאים B ו-T (א), מקרופאגים (ב), B1 ו-B2 תאים (ג) ו B1a ו B1b תאים (ד).
Discussion
בידוד של תאים חלל הצפק היא טכניקה חשובה למחקר של תאים חיסוניים שונים, בעיקר מאקרופאגים ספציפי תת תא B. אמנם זה תהליך פשוט, יש כמה שלבים קריטיים מעורב. נוכחות של זיהום בדם במדגם שנאסף יש להימנע להשיג תא טהור חלל הצפק האוכלוסייה. המתת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם צריך להיעשות בזהירות כדי למנוע זיהום דם בתוך חלל הבטן. לחילופין CO 2 יכול לשמש. בנוסף, במהלך הטיפול בהליך תקין יש לנקוט כדי למנוע ניקוב השלפוחית או לאיברים אחרים בתוך חלל הבטן. שחזור ביותר של הנוזל מוזרק חשוב גם תשואה התא.
הליך זה נעשה שימוש נרחב ללמוד ביולוגיה macrophage מאז מספרים מתונה של תושב, מקרופאגים unstimulated יכול בקלות להיות המתקבל חלל הצפק, בניגוד המשימה המפרכת להבדיל ובתאים מיאלואידית לתוך מקרופאגים בוגרת במבחנה, באמצעות המושבה macrophage גורם מגרה (8 , 9). התשואה macrophage מתוך חלל הצפק ניתן לשפר על ידי שימוש בשיטת התמחרות thioglycollate, למרות השימוש thioglycollate עשוי לשנות את המאפיינים הפיזיולוגיים של מקרופאגים (7).
בתאי B הם חלק חשוב של המערכת החיסונית שלנו משחקת תפקיד מכריע הן חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות. בין תאים שונים subpopulations B, תאים B1 מהווים קבוצת משנה ייחודית של תאים B המעורבים חסינות אוטואימוניות מולדת, תקנה החיסונית. בתאים B1 ממוקמים בעיקר חלל הצפק הם חידוש עצמי. הם אחד היצרנים העיקריים של IgM טבעי המספק את השורה הראשונה של הגנה כנגד מספר וירוסים וחיידקים (10-12). בתאים B1 הם גם מקור עיקרי של IL-10 (6), המהווה ציטוקינים חשוב המעורב בויסות החיסון. למרות מספר מחקרים כבר נרדף עם התאים B1, עדיין יש מרחב לצורך הערכה נוספת של פונקציות מנוגדות שלהם, במיוחד תפקיד הפיקוח שלהם. חלל הצפק תא שיטת בידוד מספק הזדמנות ייחודית ללמוד את הפונקציות של תאים B1.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH מענק AI069358 וקרן מחקר BloodCenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD Biosciences | 211716 |
References
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
