Summary
स्तनधारियों में peritoneal गुहा अलग प्रतिरक्षा सेल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण आबादी शामिल हैं. एक कुशल अलगाव विधि इन कोशिकाओं के जैव रासायनिक और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक है. यहाँ हम माउस में peritoneal गुहा कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक व्यापक विधि प्रदान करते हैं.
Abstract
peritoneal गुहा स्तनधारियों की एक झिल्ली ही सीमित है और तरल पदार्थ से भरे उदर गुहा, जो जिगर, तिल्ली, गैस्ट्रो आंत्र पथ और अन्य आंत का सबसे शामिल है. यह मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक संख्या बंदरगाहों. peritoneal गुहा में भोले मैक्रोफेज के एक उच्च संख्या की उपस्थिति भोले ऊतक निवासी मैक्रोफेज (1) के संग्रह के लिए एक पसंदीदा स्थल बना देता है. peritoneal गुहा भी है एक अद्वितीय peritoneal गुहा निवासी बी सेल सबसेट पारंपरिक B2 कोशिकाओं को अतिरिक्त B1 कोशिकाओं के रूप में में जाना जाता है की उपस्थिति की वजह से बी कोशिकाओं के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. B1 कोशिकाओं B1a और B1b कोशिकाओं, जो CD11b और CD5 की सतह अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है में subdivided रहे हैं. B1 कोशिकाओं प्राकृतिक रोगज़नक़ों (2-4) की एक किस्म से जल्दी सुरक्षा प्रदान आईजीएम का एक महत्वपूर्ण स्रोत हैं. इन कोशिकाओं को प्रकृति (5) में autoreactive हैं, लेकिन वे कैसे autoimmunity को रोकने के लिए नियंत्रित कर रहे हैं अभी भी पूरी तरह से नहीं समझा जाता है. CD5, इसके विपरीत पर
Protocol
- प्रक्रिया को शुरू करने से पहले, निम्नलिखित मदों एकत्र की है और तैयार होने की जरूरत है:
- बर्फ़
- 27G सुई के साथ 5ml सिरिंज
- 25g सुई के साथ 5ml सिरिंज
- स्टायरोफोम ब्लॉक और माउस बढ़ते के लिए पिंस
- ट्रे बढ़ते ब्लॉक जिस पर रखा जा सकता है
- कैंची और संदंश
- संग्रह ट्यूब
- 70% इथेनॉल
- पीबीएस के साथ 3% भ्रूण बछड़ा (FCS) सीरम (प्री ठंडा और बर्फ पर रखा)
- माउस euthanize, यह 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे और इसे अपनी पीठ पर स्टायरोफोम खंड पर माउंट.
- एक कैंची और संदंश का प्रयोग peritoneum के बाहरी त्वचा में कटौती और धीरे इसे वापस खींचने के लिए भीतर peritoneal गुहा के अस्तर में त्वचा का पर्दाफाश.
- Peritoneal गुहा में एक 27G सुई का उपयोग बर्फ के ठंडे पीबीएस (3% FCS के साथ) के 5 मिलीलीटर इंजेक्षन. सावधान पंचर करने के लिए नहीं जा रहा है किसी भी अंगों peritoneum में सुई धीरे पुश.
- इंजेक्शन के बाद, धीरे पेरिटोनियम मालिश पीबीएस समाधान में किसी भी संलग्न कोशिकाओं को हटाना.
- एक 25 ग्राम सुई बेवल, ऊपर सम्मिलित करें, peritoneum में 5 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी है और तरल पदार्थ इकट्ठा जबकि सुई की नोक धीरे चलती वसा ऊतकों या अन्य अंगों द्वारा clogging से बचने के. संभव के रूप में अधिक तरल पदार्थ के रूप में ले लीजिए और सिरिंज से सुई को हटाने के बाद बर्फ पर रखा ट्यूबों में एकत्र सेल निलंबन जमा.
वैकल्पिक: दोहराएँ कदम 4-6 - Peritoneum के भीतर की त्वचा में एक चीरा और जबकि एक संदंश के साथ त्वचा धारण एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए गुहा से शेष तरल पदार्थ इकट्ठा.
- यदि चरण में 6 या 7 दिखाई रक्त संदूषण का पता चला है तब नमूना दूषित त्याग किया जाना चाहिए.
- 1500 RPM में 8 मिनट के लिए एकत्र सेल निलंबन, स्पिन सतह पर तैरनेवाला त्यागने और गिनती के लिए वांछित मीडिया या पीबीएस में कोशिकाओं resuspend.
वैकल्पिक प्रोटोकॉल thioglycollate प्राप्त मैक्रोफेज हासिल:
इस विधि मैक्रोफेज के एक उच्च उपज प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- 3% (w / v) प्रत्येक माउस के peritoneal गुहा में शराब बनानेवाला thioglycollate मध्यम (7) के 5 मिलीलीटर इंजेक्षन.
- 3-5 दिनों के लिए प्रतीक्षा करें, और कोशिकाओं के संग्रह के लिए 1 से ऊपर कदम आगे बढ़ना.
Nonelicited दृष्टिकोण की तुलना में लगभग 10 गुना अधिक मैक्रोफेज एकत्र किया जा सकता है. केवल चिंता का विषय है कि इस प्रक्रिया द्वारा प्राप्त मैक्रोफेज अपनी शारीरिक गुणों के कुछ अलग है.
प्रतिनिधि परिणाम:
एक unmanipulated माउस से 5-10 मिलियन peritoneal गुहा कोशिकाओं को एक अच्छा अलगाव प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया जा सकता है. सभी जीवित कोशिकाओं के बीच 50-60% बी कोशिकाओं रहे हैं, ~ 30% मैक्रोफेज और 5-10% टी कोशिकाओं (चित्र 1) कर रहे हैं.
चित्रा 1. Peritoneal गुहा से अलग कक्षों की phenotype peritoneal गुहा वे कोशिकाओं के बाद अलगाव के साथ दाग थे विरोधी माउस TCRβ FITC, B220 पीई टेक्सास लाल, CD11b प्रशांत नीले CD23 पीई Cy7 और CD5 APC. प्रतिनिधि प्रवाह cytometric भूखंडों बी और टी कोशिकाओं (एक), (ख) मैक्रोफेज, B1 और B2 कोशिकाओं (ग) और B1a और B1b कोशिकाओं (घ) के प्रतिशत दिखा.
Discussion
Peritoneal गुहा कोशिकाओं के अलगाव अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं, मुख्य रूप से मैक्रोफेज और विशिष्ट बी सेल सबसेट के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है. हालांकि यह एक साधारण प्रक्रिया है, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं. एकत्र नमूने में रक्त contaminating की उपस्थिति के लिए एक शुद्ध peritoneal गुहा सेल की आबादी को प्राप्त करने के लिए बचा जाना चाहिए. ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु सावधानी से किया जाना चाहिए peritoneal गुहा में रक्त संक्रमण से बचने के लिए. वैकल्पिक रूप से सीओ 2 इस्तेमाल किया जा सकता है . इसके अलावा, उचित देखभाल प्रक्रिया के दौरान peritoneal गुहा में puncturing मूत्राशय या किसी भी अन्य अंगों से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. इंजेक्शन तरल पदार्थ का सबसे पुनर्प्राप्त भी सेल उपज के लिए महत्वपूर्ण है.
इस प्रक्रिया को व्यापक रूप से निवासी के मध्यम संख्या से बृहतभक्षककोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, unstimulated मैक्रोफेज peritoneal गुहा से आसानी से प्राप्त कर सकते हैं परिपक्व मैक्रोफेज में माइलॉयड पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं इन विट्रो में, फर्क बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (8 का उपयोग कर का श्रमसाध्य कार्य करने के लिए इसके विपरीत में, हो 9). peritoneal गुहा से बृहतभक्षककोशिका उपज thioglycollate निकालना पद्धति का उपयोग करके करके सुधार किया जा सकता है, हालांकि thioglycollate उपयोग मैक्रोफेज (7) के शारीरिक गुणों को बदल सकता है.
बी कोशिकाओं हमारी प्रतिरक्षा प्रणाली के दोनों सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली में महत्वपूर्ण भूमिका निभा एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं. अलग बी सेल subpopulations के अलावा, B1 कोशिकाओं बी कोशिकाओं सहज रोगक्षमता, autoimmunity और प्रतिरक्षा विनियमन में शामिल की एक अद्वितीय सबसेट शामिल हैं. B1 कोशिकाओं को मुख्य रूप से peritoneal गुहा में स्थित हैं और स्वयं भरपाई कर रहे हैं. वे प्राकृतिक आईजीएम जो वायरस और बैक्टीरिया (10-12) की एक संख्या के खिलाफ सुरक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करता है के प्राथमिक उत्पादकों में से एक हैं. B1 कोशिकाओं को भी 10-आईएल (6) है, जो एक महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा विनियमन में शामिल साइटोकाइन है की एक प्रमुख स्रोत हैं. हालांकि कई अध्ययनों B1 कोशिकाओं के साथ जारी है, अभी भी उनकी विषम कार्यों के मूल्यांकन के लिए आगे गुंजाइश है, विशेष रूप से उनके नियामक भूमिका है. Peritoneal गुहा सेल अलगाव विधि अद्वितीय B1 कोशिकाओं के कार्यों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में NIH अनुदान AI069358 और BloodCenter रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD Biosciences | 211716 |
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