Summary
포유류의 복막 캐비티는 타고난 면역 반응에 중요한 다른 면역 세포 인구가 포함되어 있습니다. 효율적인 분리 방법은 이러한 세포의 생화 학적 및 기능적 분석이 필요합니다. 여기서 우리는 마우스의 복막 공동 세포의 격리를위한 포괄적인 방법을 제공합니다.
Abstract
복막 구멍은 간, 비장, gastro - 창자 및 기타 내장의 대부분을 포함하고 포유류의 막 - 바운드와 유체 가득한 복강입니다. 그것은 macrophages, B 세포와 T 세포를 포함한 면역 세포의 숫자를 항구. 복막 캐비티에 순진한 macrophages 높은 숫자의 존재는 순진 조직 주민 macrophages (1)의 수집을 위해 선호하는 사이트를 만듭니다. 복막 캐비티도 있기 때문에 기존의 B2 셀에 이외에 지하 1 층 세포로 알려진 독특한 복막 캐비티 상주 B 세포 부분 집합의 존재의 B 세포의 연구에 중요합니다. B1 세포는 CD11b와 CD5의 표면 표현으로 구분할 수 B1a하고 B1b 세포로 세분화됩니다. B1 세포가 병원균 (2-4)의 다양한 초기 보호를 제공하는 자연 IgM의 중요한 소스입니다. 이러한 세포는 자연 (5)에 autoreactive 있지만, 그들이 autoimmunity을 방지하기 위해 관리하는 방법은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 반대로, CD5에
Protocol
- 프로세스를 시작하기 전에 다음 항목 수집 및 준비에 필요 :
- 얼음
- 27g 바늘로 5ml 주사기
- 25g 바늘로 5ml 주사기
- 스티로폼 블록 및 마우스를 장착을위한 핀
- 장착 블록 배치 수있는 트레이
- 가위와 집게
- 컬렉션 튜브
- 70 % 에탄올
- PBS로 3퍼센트 소태아 혈청 (FCS) (예약 얼음에 냉장 및 보관)
- 마우스를 안락사, 70 % 에탄올로 스프레이하고 뒷면에있는 스티로폼 블록에 탑재합니다.
- 가위와 집게를 사용하면 복막의 바깥쪽 피부를 잘라 부드럽게 복막 구멍을 내벽 안쪽 피부를 노출 다시 가져옵니다.
- 27g 바늘을 사용하여 복막 구멍에 얼음 차가운 PBS (3 % FCS 포함) 5 ML을 주사. 어떤 장기 조심하지 펑크로되는 복막에 천천히 바늘을 밀어.
- 주입 후, 부드럽게 PBS 용액에 어떤 부착된 세포를 이동시키다하는 복막 마사지.
- 복막에 5 ML의 주사기에 부착된, 25g 바늘, 베벨을 삽입하고 지방 조직이나 다른 기관에 의해 막히는 것을 방지할 수 부드럽게 바늘의 팁을 이동하면서 유체를 수집합니다. 가능한 한 많은 유체로 수집하고 주사기에서 바늘을 제거한 후에 얼음에 보관 튜브에 수집한 세포 현탁액을 입금.
옵션 : 4-6 단계를 반복 - 복막의 내부 피부에 절개를 만들고 포셉로 피부를 누른 상태 것은 구멍에서 남아있는 유체를 수집하는 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
- 단계에서 6, 7 볼 혈액 오염이 감지되면 다음 오염된 샘플을 폐기해야합니다.
- 8 분 동안 1,500 RPM에서 수집된 세포 현탁액을 스핀 뜨는를 버리고 계산을 위해 원하는 미디어 또는 PBS에 세포를 resuspend.
thioglycollate를 얻는 다른 프로토콜 macrophages을 elicited :
이 방법은 macrophages 높은 수율을 얻을하는 데 사용됩니다.
- 3퍼센트 (W / V) 각 마우스의 복막 구멍에 브루어 thioglycollate 미디어 (7) 5 ML을 주사.
- 3~5일 기다려, 그리고 세포의 수집에 대한 위의 1 단계를 진행합니다.
nonelicited 접근 방식에 비해 약 10 배 이상 macrophages가 수집하실 수 있습니다. 유일한 관심사는이 절차에 의해 얻은 macrophages 자신의 생리 특성의 일부가 다르다는 것입니다.
대표 결과 :
unmanipulated 마우스, 5-10000000 복막 캐비티 세포는 좋은 격리 프로토콜로 구할 수 있습니다. 모든 생활 세포 가운데 50-60%는 B 세포 있으며, ~ 30 % macrophages 및 50~10%는 T 세포 (그림 1)입니다.
그림 1. 복막 캐비티으로부터 격리 세포의 표현형. 복막 캐비티 세포들은의 다음과 같은 분리는 물들일되었습니다 방지 마우스 TCRβ - FITC, B220 - PE - 텍사스 빨강, CD11b 태평양 파랑, CD23 - PE - Cy7 및 CD5 - APC. 대표 흐름 cytometric 플롯은 B와 T 세포 (A), macrophages (B), B1과 B2 셀 (C)와 B1a 및 B1b 세포 (D)의 비율을 보여줍니다.
Discussion
복막 캐비티 세포의 격리는 다른 면역 세포, 주로 macrophages 및 구체적인 B 세포 하위 집합의 연구를위한 중요한 기술이다. 이 간단한 과정이지만, 관련된 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 수집된 샘플의 혈액을 오염의 존재는 순수 복막 캐비티 세포 인구를 얻을 피해야한다. 자궁 경부 전위에 의해 안락사는 복막에 고인 혈액 오염을 피하기 위해 신중하게 이루어져야합니다. 또는 CO 2를 사용할 수 있습니다. 또한, 프로 시저 적절한 치료 도중 복막 구멍에있는 방광이나 다른 장기 펑쳐링 않도록 주의해야한다. 주입 액의 대부분을 복구하면 세포 수율하는 것이 중요합니다.
이 절차는 널리 주민의 중간 번호부터 대식 세포 생물학을 연구하는 데 사용됩니다, unstimulated macrophages 쉽게 대식 세포 콜로니 자극 인자 (8을 사용하여 체외에서 성숙 macrophages에 골수양 전구 세포를 차별 힘드는 작업과는 달리, 복막 캐비티에서 얻을 수 있습니다 , 9). thioglycollate 사용이 macrophages (7)의 생리적 특성을 변경할 수도 있지만 복막 캐비티에서 대식 세포 수율은 thioglycollate의 이끌어 냄 메서드를 사용하여 향상시킬 수 있습니다.
B 세포는 타고난과 적응 면역 모두에 중요한 역할을 우리 면역 체계의 중요한 부분입니다. 다른 B 세포 subpopulations 중에서 B1 세포는 타고난 면역, autoimmunity 및 면역 조절에 관여 B 세포의 고유한 하위 집합을 구성. B1 세포는 주로 복막 캐비티에 위치하고 있으며 자체 replenishing입니다. 그들은 바이러스의 번호와 박테리아 (10-12)에 대한 보호의 첫 번째 라인을 제공하고 자연 IgM의 주요 생산자 중 하나이다. B1 세포는 또한 면역 조절에 관여하는 중요한 시토킨는 IL - 10 (6)의 주요 원천입니다. 여러 연구가 B1 세포와 함께 추진되고 있지만, 아직 특별히 자신의 대조 기능을 추가로 평가를 위해 규제의 역할 범위가있다. 복막 캐비티 세포 분리 방법은 B1 세포의 기능을 연구하는 독특한 기회를 제공합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 부여 AI069358 및 BloodCenter 연구 재단에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD Biosciences | 211716 |
References
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
