Summary
Брюшной полости у млекопитающих содержит различные иммунные клеточные популяции важно для врожденного иммунного ответа. Эффективный метод изоляции требуется для биохимических и функциональных анализов этих клеток. Здесь мы предлагаем комплексный метод для изоляции брюшной полости в клетках мыши.
Abstract
Брюшной полости является мембраной и заполненные жидкостью брюшной полости млекопитающих, в котором содержится в печени, селезенке, большинство из желудочно-кишечного тракта и других внутренних органов. Она таит в себе число иммунных клеток, включая макрофаги, В-клетки и Т-клеток. Наличие большого числа наивных макрофагов в брюшную полость делает его предпочтительным местом для сбора наивно ткани резидент макрофагов (1). Брюшной полости также имеет важное значение для изучения В-клетки из-за наличия уникальных брюшную полость-нерезиденты В-клеток подмножество известного как B1 клеток в дополнение к обычной ячейки B2. В1 клетки подразделяются на B1a и B1b клеток, которые можно отличить по поверхности выражение CD11b и CD5. В1 клетки являются важным источником природных IgM обеспечения раннего защиту от разнообразных патогенов (2-4). Эти клетки аутореактивных в природе (5), но как они находятся под контролем, чтобы предотвратить аутоиммунные до сих пор не поняли полностью. Напротив, CD5
Protocol
- Перед началом процесса, следующие элементы должны быть собраны и подготовлены:
- Лед
- 5 мл шприц с иглой 27 г
- 5 мл шприц с иглой 25g
- Пенополистирол блока и булавки для крепления мыши
- Лоток, на котором монтажный блок может быть размещен
- Ножницы и пинцеты
- Коллекция труб
- 70% этанола
- PBS с 3% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) (предварительно охлажденных и держится на льду)
- Эвтаназии мыши, распылить это с 70% этанола и закрепить его на блок пенополистирола на спине.
- Использование ножницы и щипцы сократить внешнюю оболочку брюшины и осторожно потяните его назад подвергать кожу внутренней подкладкой брюшную полость.
- Inject 5 мл ледяной PBS (с 3% FCS) в брюшную полость использованием 27 г иглы. Нажимаем иглу медленно в брюшину стараясь не прокол любого из органов.
- После инъекции массируют брюшины выбить все подключенные клетки в раствор PBS.
- Вставьте иглу 25 г, конические вверх, прилагается к 5 мл шприца в брюшину и сбора жидкости при перемещении кончика иглы осторожно, чтобы избежать засорения жировой ткани или других органов. Сбор столько жидкости, сколько возможно, и депозит собраны клеточной суспензии в трубках держится на льду после удаления иглы от шприца.
Дополнительно: Повторите шаг 4-6 - Сделайте разрез в коже внутренней брюшины и, удерживая до кожу щипцами использовать пластиковые пипетки Пастера, чтобы собрать остатки жидкости из полости.
- Если в шаге 6 или 7 видимого загрязнения крови обнаруживается то загрязненные образцы должны быть отброшены.
- Спиновые собраны клеточной суспензии при 1500 оборотов в течение 8 минут, удалите супернатант и ресуспендирования клеток в желаемый носитель или PBS для подсчета.
Альтернативный протокол для получения тиогликолята вызвало макрофагов:
Этот метод используется для получения высокой доходности макрофагов.
- Inject 5 мл 3% (м / о) Брюер тиогликолята средний (7) в брюшную полость каждого мыши.
- Ждите в течение 3-5 дней, и переходите к шагу 1 выше, для сбора клеток.
По сравнению с nonelicited подход, примерно в 10 раз больше макрофаги могут быть собраны. Единственной заботой является то, что макрофаги, полученные этим процедуры отличаются в некоторых из своих физиологических свойств.
Представитель результаты:
С unmanipulated мыши, 5-10 млн. перитонеальных клеток полости могут быть получены с хорошими протокол изоляции. Среди всех живых клеток, 50-60% составляют В-клетки, ~ 30% макрофагов и 5-10% являются Т-клетки (рис. 1).
Рисунок 1. Фенотип клеток, выделенных из брюшной полости. После изоляции перитонеальных клеток полости они были окрашены антимышиным TCRβ-FITC, B220-PE-Техас красный, CD11b-Тихоокеанского синий, CD23-PE-Cy7 и CD5-APC. Представитель проточной цитометрии графики показывают процент B и Т-клетки (а), макрофагов (б), B1 и B2 клеток (с) и B1a и B1b клеток (г).
Discussion
Выделение перитонеальных клеток полости важный метод для изучения различных иммунных клеток, в первую очередь макрофаги и конкретные подмножества клеток. Хотя это простой процесс, Есть некоторые критические этапы. Наличие загрязняющих крови в собранных образцов следует избегать, чтобы получить чистые популяции клеток перитонеальной полости. Эвтаназия цервикальным сдвигом должно быть сделано аккуратно, чтобы избежать загрязнения крови в брюшной полости. Кроме CO 2 может быть использован. Кроме того, во время процедуры надлежащего ухода должны быть приняты, чтобы избежать проколов пузырь или любых других органов в брюшную полость. Восстановление большинство вводимой жидкости также имеет важное значение в ячейку доходности.
Эта процедура широко используется для изучения биологии макрофагов с умеренным количеством житель, нестимулированных макрофаги могут быть легко получены из брюшной полости, в отличие от трудоемкой задачей дифференциации миелоидных клеток-предшественников в зрелые макрофаги в пробирке, используя макрофаг колониестимулирующий фактор (8 , 9). Макрофагов выход из брюшной полости может быть улучшено с помощью метода тиогликолята выявление, хотя тиогликолята использование могло бы изменить физиологические свойства макрофагов (7).
В-клетки являются важной частью нашей иммунной системы играет решающую роль в обоих врожденного и адаптивного иммунитета. Среди различных субпопуляций В-клеток, В1 клетки составляют уникальное подмножество B клеток, участвующих в врожденного иммунитета, аутоиммунные заболевания и иммунной регуляции. В1 клетки в основном расположены в брюшной полости и не требуют пополнения. Они являются одним из первичных производителей природного IgM, которая обеспечивает первую линию защиты против ряда вирусов и бактерий (10-12). В1 клетки также основным источником IL-10 (6), который является важным цитокинов, участвующих в иммунной регуляции. Хотя некоторые исследования были проводиться с В1 клетки, по-прежнему есть возможности для дальнейшей оценки их контрастные функций, специально их регулирующей роли. Брюшную полость изолятор метод дает уникальную возможность изучить функции B1 клеток.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при частичной поддержке гранта NIH AI069358 и Фонда BloodCenter исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD Biosciences | 211716 |
References
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
