レンチウイルスの生産

Summary

レンチウイルスを作成するには、DNAベクターは、ヒト293細胞にトランスフェクトされています。収穫後、上清を濃縮し、ウイルス力価は、フローサイトメーターと蛍光式によって決定されます。

Abstract

RNA干渉（RNAi）は、生きた細胞内の遺伝子サイレンシングのシステムです。 RNAi実験では、短い干渉RNA（siRNA）のシーケンスの相同遺伝子は、転写後の状態で沈黙している。ショートヘアピンRNA、siRNAに前駆体は、種々の細胞型におけるRNAiを可能に、レンチウイルスを用いて表現することができる。このようなヒト免疫不全ウイルスのようなレンチウイルスは、感染の両方で割ると、非分裂細胞に対応しています。我々は、レンチウイルスをパッケージ化する手順を説明します。パッケージングは​​、DNAベクターから有能なウイルスの準備を指します。レンチウイルスベクターの生産システムは、天然のウイルスゲノムは、個々のヘルパープラスミドコンストラクトに分割された"分割"システムに基づいています。 4つの別々のベクターに異なるウイルスの要素のこの分裂は、レンチウイルスゲノムの不定組換えによる複製が可能なウイルスを作成することのリスクを減少させる。ここでは、関心と3種類のパッケージでベクトル（P - VSVG、pRSV、PMDL）のshRNAを含むベクターを、一過性のヒト293細胞にトランスフェクトされています。少なくとも48時間のインキュベーション期間の後、ウイル​​スを含む上清を回収し、濃縮する。最後に、ウイルスの力価は、レポーター（蛍光灯）フローサイトメーターによる式によって決定されます。

Protocol

パート1：レンチウイルスを生成するためにHEK 293細胞のトランスフェクション

* 24時間50から70パーセント翌日のコンフルエントのため10 cmディッシュにトランスフェクション、プレート2.5 × 10 ^6個の細胞の前に。

1. 一つ後のウイルスを下すために、単一の細胞をトランスフェクトするとなるとDNAを調製してこのプロトコルを開始します。最初に、FuGENE 6トランスフェクション試薬ロシュ、細胞がDNAを取るように脂質の試薬を希釈する。 1.5 mlチューブに、ピペット30μlのFuGENE 6トランス600ulの無血清培地に（SFDMEM）。それは媒体に配信されるようにトランスフェは、チューブの側面に接触させてように注意してください。このトランスフェと5分間室温でSFDMEMミックスとインキュベートしてみましょう。
2. チューブのキャップでは、それぞれの第³世代ウイルスパッケージングベクトル（PMDL、pRSVとpVSV - G）は、4μgのレンチウイルスプラスミド4μgのを混ぜる。レンチウイルスプラスミドは、パッケージングベクターがレンチウイルスを作るために必要なすべての他のタンパク質の遺伝子を含んでいる間、ウイルスは、それが感染するすべての細胞のゲノムに挿入するDNAが含まれています。
3. チューブを反転させて蓋をし、混合数回を閉じます。
4. 室温で15-20分インキュベートする。
5. 293プレートへのチューブのピペット全体の内容。前後に傾斜板で静かに混和。
6. インキュベーターにセルを戻すと、ウイルス産生が収穫前48〜96時間継続することができます。
7. インキュベーションの間、293細胞は、レンチウイルスコンストラクトのRNAのコピーを作成し、レンチウイルスプラスミドから目的のDNAを転写する。彼らはまた、ウイルス蛋白質へのパッケージングベクター中の遺伝子を転写し、翻訳する。これらのタンパク質は、ウイルスが転写するを逆転させ、それが感染するすべての細胞のゲノムに挿入するあなたのレンチウイルスコンストラクトのRNAのバージョンを含むウイルスを作るに進んでください。

第2部：レンチウイルス収穫

1. 潜伏期間の後、インキュベーターから細胞を取り出し、現在ウイルスを含む上清を除去するために使い捨て、10mlのシリンジを使用してください。上清10mlを約あるでしょう。
2. 先端に0.45μMシリンジフィルターを取り付け、ベックマンの超遠心管にウイルスをフィルタリングする。フィルタはウイルスではなく、細胞が通過することができます。
3. 廃棄する前に、すべてのウイルス産生細胞、培養プレート、45分間10％の漂白剤のシリンジとフィルターをインキュベートする。

パート3：超遠心法を経由してレンチウイルス濃度

1. SW - 41TiまたはSW - 28ローターバケットに遠心管をロードする。
2. すべてのウイルスを含むチューブに0.2グラム内のバランスをとるために無血清DMEMを使用してください。
3. 超遠心機内部のローターを配置する前に、ローターバケットをシャットダウンして、ローターの上にそれらをフック封印
4. 4℃で超遠心機で90分間ウイルスをスピン· SW - 41Tiローターで25000回転またはSW - 28ローターで24000 rpmでC。
5. 組織培養フードの中で、10％の漂白剤を入れた容器に上清を注ぐために逆さにチューブを反転させる。
6. ペレットの周りに余分な液体を吸収し、5分を超えないために便利なラックにチューブを反転させるためにキムワイプを使用してください。
7. ウイルスのペレットを再度中断するには、約20回上下にピペッティングして、チューブに100μLの滅菌PBSを追加するには、フィルターチップを使用。
8. 再懸濁完了する℃で一晩4℃でウイルスを残す。一つは、約1週間と1年まで-80℃で4℃でウイルスプレップを保存することができます。廃棄するまでに10％漂白剤ですべての空のチューブを扱うことをお忘れなく。
9. いずれかの1週間よりも長くウイルスprepを使用しようとする場合、最小限の将来の実験のための5 -20μlののアリコートと滴定のための5μlの3の1アリコートを行います。マイナス80℃アリコートを凍結して保存する。

パート4：フローサイトメトリーを用いてレンチウイルス滴定

1. 次のステップは、フローサイトメトリーにより、ウイルス力価を決定することです。このメソッドは、レンチウイルスプラスミドは、蛍光レポーター遺伝子が含まれている場合に動作します。アイデアは、ウイルスが細胞に感染した場合、それはその細胞のゲノムにレンチウイルスプラスミドDNAを導入することです。感染細胞は、転写と翻訳が含まれている遺伝子をレンチウイルスプラスミドにし、蛍光レポーター遺伝子が含まれていると、感染細胞は蛍光を発するでしょう。蛍光のレベルは、ウイルスの効力、または力価を、表します。
2. 滴定する各ウイルス株については、完全なメディアを1.5 ml（DMEM、ペン連鎖球菌、グルタミン、FBS）に濃縮されたウイルスの3μlを希釈する。
3. 96ウェルプレートの1行目の井戸1-6に、以下の連続希釈を行います：全6ウェルに完全DMEM培地を100μlを加える。ウェルを100μlを加えるだけでなく秒に、（これは未染色のコントロールです）がないウイルスとメディアの100μLを追加する第三者に、希釈したウイルス液100μlを（希釈ウイルスと同等の最高1ミリリットルである）最初に追加するによく秒からミックス、よくよく第五に、よく3日から100 mlを加えるだけでなく第四井戸から、目と6番目に100μLを加えるも5日から100μlを加える4位に。最後に第六井戸から100ulを取り出して、漂白剤で捨てる。各ウェルは、その前のに比べてウイルスの半分のボリュームを持っている場所連続希釈を行った。
4. 200μlのためにすべてのウェルの総量をもたらす。これらが最も集中してウイルスを力価測定のために働く必要は推奨希釈率、であることに注意してください。ウイルスは、力価の低い場合、または未濃縮場合、1つは、希釈を調整する必要があります。
5. バイオハザード廃棄物容器に廃棄する前に45分間、10％漂白剤で使用されていない希釈したウイルスを扱う。
6. 6ウェルの各々に〜15,000健全な、活発に分裂した293細胞を追加。シングル96ウェルプレートは、16のウイルスプレップを力価に使用することができます。
7. 5％のCOと37度のインキュベーターにセルを返す_2、感染が少なくとも48時間続行することができます。
8. インキュベーション後、細胞をフローサイトメーターで（我々の場合の蛍光で）レポーターの発現を分析している。ウイルス粒子は、ウェルあたりの蛍光細胞の割合によって定量される。

次の式でmlあたり感染単位数を計算します。

_{（＃感染Xのレポーター陽性細胞の日にウェルあたりの細胞の）X 1000}
^{______________________________________________________
ベクトルのmlのウェルに添加}

パート5：代表的な結果：

48時間のインキュベーション期間の後のトランスフェクションした後、293細胞のプレートは、蛍光灯約90％になっているはず。蛍光細胞の割合が高いウイルス産生細胞の割合が高いの指標です。

再懸濁するときに遠心分離した後、ウイル​​スペレットはほとんど見えないです。ペレットは透明で非常に小さいため、これは正常です。

細胞は細胞ごとに1つしかウイルスの統合を受けている（蛍光灯）に感染したときに一つだけ正確な力価の計算を達成することができるフローサイトメーターの結果の解釈、注意してください。これが事実であることを保証するために、計算のための<15％の感染率を持つ細胞を使用してください。高い感染率を有する細胞は、おそらく、セルごとに複数のウイルスintegrantsを受けている。手順2で提案された希釈液は、感染症のこの範囲内でいくつかのサンプルを生成する必要があります。理想的には、最後の力価を計算することができますが、必要に応じて、単一のサンプルを用いて力価を計算できるから滴定プロット（直線）を生成するためにいくつかのサンプルを使用してください。一つは、1.0 × 10 ⁷ TU非濃縮したウイルスのための/ mlおよび1.0 × 10 ⁸濃縮したウイルスのためのTU / mlの力価が期待できます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.