Lentivirus Produktion

Summary

För att göra lentiviruses, är DNA-vektorer transfekterade i människors 293 celler. Efter skörden och koncentrera supernatanten är virus titer bestäms av fluorescens uttryck med en flödescytometer.

Abstract

RNA-interferens (RNAi) är ett system av geners uttryck i levande celler. I RNAi, gener homologa i ordning för att korta interfererande RNA (siRNA) är tystade på efter transkriptionella tillstånd. Kort hårnål RNA, prekursorer till siRNA, kan uttryckas med hjälp av lentivirus, vilket möjliggör RNAi i en mängd olika celltyper. Lentiviruses, såsom humant immunbristvirus, är kapabla att infektera både dela och icke-delande celler. Vi kommer att beskriva ett förfarande som att paketera lentiviruses. Förpackning syftar till att förbereda behöriga viruset från DNA-vektorer. Lentiviral vektor produktionssystem bygger på en "split" system, där det naturliga virala genomet har delats upp i enskilda hjälpare plasmid konstruktioner. Denna uppdelning av de olika virala element in i fyra separata vektorer minskar risken att skapa en replikering-kapabel virus genom oavsiktlig rekombination av Lentiviral genomet. Här är en vektor som innehåller shRNA av intresse och tre vektorer förpackning (p-VSVG, pRSV, pMDL) övergående transfekterade i människors 293 celler. Efter minst ett 48-timmars inkubationstid, viruset som innehåller supernatanten skördas och koncentrerad. Slutligen är virus titer bestäms av reportern (fluorescerande) uttryck med en flödescytometer.

Protocol

Del 1: transfektion av HEK 293 celler att producera Lentiviruses

* 24 timmar innan transfektion, platta 2,5 x 10 ⁶ celler i ett 10 cm skål för en confluency på 50-70% nästa dag.

1. Starta detta protokoll genom att förbereda DNA som ett senare kommer transfektera en celler för att göra virus. Först, späd FuGENE 6 Roche Transfektion reagens, en lipid reagens som gör att cellerna tar upp DNA. I ett 1,5 ml rör, pipett 30μl FuGENE 6 i 600ul serumfritt medium (SFDMEM). Var noga med att inte låta FuGENE röra sidan av röret när den levereras in i mediet. Låt denna FuGENE och SFDMEM blanda och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
2. I locket på röret, blanda 4 mikrogram Lentiviral plasmid med 4 mikrogram var 3: ^e generationens virala förpackningar vektorer (pMDL, pRSV och pVSV-G). Den Lentiviral plasmid innehåller DNA-viruset kommer in i genomet i varje cell det smittar, medan förpackningar vektorerna innehåller gener för alla andra proteiner som krävs för att göra en lentivirus.
3. Stäng locket och blanda genom att vända röret några gånger.
4. Inkubera 15-20 minuter i rumstemperatur.
5. Pipettera hela innehållet i röret i 293 tallrik. Blanda försiktigt genom att luta plattan fram och tillbaka.
6. Återgå cellerna till inkubatorn och låta virus produktionen att fortsätta i 48-96 timmar innan skörd.
7. Under inkubation, de 293 cellerna transkribera DNA intresse från Lentiviral plasmiden, skapa en RNA-kopia av Lentiviral konstruera. De transkribera också och översätta gener i förpackningen vektorer i virus-proteiner. Dessa proteiner går att göra virus med RNA-versionen av Lentiviral konstruera, som viruset kommer att vända transkribera och lägg in i kartläggningen av alla celler det smittar.

Del 2: Lentiviral Harvest

1. Efter inkubationstid, ta celler ur kuvösen och använda en disponibel, 10 ml sprutan för att avlägsna supernatanten, som nu innehåller viruset. Det kommer att vara cirka 10 ml av supernatanten.
2. Bifoga en 0.45μM sprutfilter till spetsen och filtrera viruset till en Beckman ultracentrifugen rör. Filtret tillåter bara virus, och inte cellerna att passera.
3. Innan kasta, inkubera alla virus-producerande celler, odlingsplattor, sprutor och filter i 10% blekmedel i 45 minuter.

Del 3: Lentiviral Koncentration via ultracentrifugering

1. Ladda centrifugrör i SV-41Ti eller SW-28 rotorn hinkar.
2. Använd serumfritt DMEM att balansera alla virus som innehåller rör till inom 0,2 g.
3. Seal stängde rotor hinkar och haka dem på rotorn innan du placerar rotor inuti ultracentrifugen
4. Spin viruset i 90 minuter i en ultracentrifugen vid 4 ° C vid 25.000 rpm i en SW-41Ti rotor eller 24.000 rpm i en SW-28 rotorn.
5. I en vävnadskultur huva, invertera rör upp och ner för att hälla supernatanten i en behållare med 10% blekmedel.
6. Använd en Kimwipe att absorbera överflödig vätska runt pelleten och vända röret ett bekvämt rack för inte mer än fem minuter.
7. För att åter skjuta upp virus pellets, använda ett filter tips att lägga till 100 mikroliter steril PBS till röret, sedan pipettera upp och ner ungefär 20 gånger.
8. Lämna viruset vid 4 ° C över natten för att slutföra resuspension. Man kan lagra virus Preps vid 4 grader i ca 1 vecka och vid -80 grader i upp till ett år. Kom ihåg att behandla alla tomma rör med 10% blekmedel före kassering.
9. Om man avser att använda virala prep längre än 1 vecka, göra minimala portioner av 5-20μl för framtida experiment och en delmängd av 3 till 5μl för titreringen. Frys och förvara alikvoter vid minus 80.

Del 4: Lentiviral Titrering med flödescytometri

1. Nästa steg är att bestämma den virala titer med flödescytometri. Denna metod fungerar bara i de fall där Lentiviral plasmiden innehåller en fluorescerande reporter gen. Tanken är att när viruset infekterar en cell, introducerar den Lentiviral plasmid DNA i cellens arvsmassa. Den infekterade cellen kommer sedan transkribera och översätta de gener du ingår i Lentiviral plasmiden, och om du ingår ett fluorescerande reporter genen kommer infekterade celler fluorescerar. Nivån på fluorescens representerar styrkan eller titer av viruset.
2. För varje virus materiel som skall titered, späd 3 l koncentrerad virus i 1,5 ml av kompletta medier (DMEM, pen-STREP, glutamin, FBS).
3. I brunnar 1-6 i en enda rad i en 96 brunnar, utför följande spädningar: alla 6 brunnar tillsätt 100 l av kompletta DMEM medier. Till den första brunnen lägga 100μl av media utan virus (det här är ditt ofärgade kontroll), till den andra och tillsätt 100 ìl av utspätt virus (vilket motsvarar till1 ml outspätt virus), till den tredje och tillsätt 100 lav blandningen från den andra väl, att den fjärde och tillsätt 100 ml från den 3: e bra, den femte väl lägga 100μl från den 4: e också, och till sjätte väl lägga till 100 l från den 5: e också. Slutligen tar 100ul ur den 6: e väl och kasta i blekmedel. En seriell utspädning utfördes där varje brunn har halva mängden av virus jämfört med den föregående.
4. Att den totala mängden i alla brunnar för att 200μl. Observera att dessa endast föreslås spädningar, som bör fungera bra för titering mest koncentrerade virus. Om viruset är låg i titer eller okoncentrerade en kan behöva justera spädningar.
5. Behandla alla oanvända utspädd virus med 10% blekmedel i 45 minuter innan kasta in ett biologiskt avfallsbehållare.
6. Lägg till ~ 15 tusen friska, aktivt dela 293 celler till var och en av sex brunnar. En enda 96-brunnar kan användas för att titer 16 virala preps.
7. Återgå celler till 37 grader inkubator med 5% CO ₂ och låt infektion fortsätta i minst 48 timmar.
8. Efter inkubation är de celler analyseras för reporter uttryck (i vårt fall fluorescens) med en flödescytometer. Viruspartiklar är kvantifieras genom procent av fluorescerande celler per brunn.

Beräkna antalet infektiösa enheter per ml med följande formel:

_{(# Av celler per brunn på dag för infektion X reporter positiva celler) X 1000}
^{______________________________________________________
ml vektor läggas till väl}

Del 5: representativa resultat:

Efter en 48-timmars inkubationstid inlägg transfektion bör tallrik 293 celler på ca 90% lysrör. En stor andel av fluorescerande celler är ett tecken på en hög andel av virus celler.

Efter centrifugering är den virala pellets knappt syns när resuspending. Detta är normalt eftersom pellets är tydlig och mycket liten.

När man tolkar resultaten flödescytometer, observera att man bara kan uppnå exakt titer beräkningar när smittad (fluorescerande) celler har fått mer än ett virus integrationen per cell. För att säkerställa att så är fallet använder celler med <15% infektionsfrekvensen för beräkningar. Celler med högre smittade har troligen fått flera virala integrants per cell. De spädningar som föreslås i steg 2 bör ge flera prover inom detta intervall för infektion. Helst använda flera prover för att generera en titrering tomt (linjär linje) från vilken du kan beräkna den slutliga titer, men du kan räkna titer med ett enda prov, om det behövs. Man kan förvänta titer på 1,0 x 10 ⁷ TU / ml för icke-koncentrerat virus och 1,0 x 10 ⁸ TU / ml för koncentrerad virus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.