הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה
Summary
אנו מתארים שיטה חדשה lipidomics כמותי לזיהוי שומנים מינים רבים שמרים באמצעות סקר סריקה יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (ESI / MS). שיטה זו עולה כיום השיטות הזמינות לזיהוי שומנים וכימות ביכולת לפתור צורות מולקולריות שונים של שומנים, רגישות, ומהירות.
Abstract
ליפידים הם אחד השיעורים הגדולים של ביומולקולות ולשחק בתפקידים חשובים הדינמיקה קרום, אחסון אנרגיה, איתות<sup> 1-4</sup>. שמרים ניצני<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Eukaryote גנטית ביוכימית unicellular manipulable עם הגנום המבואר ו lipidome פשוט מאוד, הוא מודל יקר ערך לחקר תפקודים ביולוגיים של מינים השומנים השונים תאיים אאוקריוטים<sup> 2,3,5</sup>.<em> ס cerevisiae</em> יש 10 סוגים עיקריים של שומנים עם אורכי שרשרת בעיקר של 16 או 18 אטומי פחמן או אפס או אחד מידת unsaturation<sup> 6,7</sup>. השיטות הקיימות לזיהוי שומנים וכימות – כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, רזה שכבת כרומטוגרפיה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וכן גז כרומטוגרפיה ואחריו MS – מבוססים היטב, אבל יש רגישות נמוכה, נפרד מספיק צורות מולקולריות שונים של שומנים, שומנים derivitization דורשים מראש לניתוח, או יכול להיות די זמן רב. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של גישה ניסויית שלנו כדי לפתור את המגבלות הטמונות באמצעות סקר סריקה ESI / MS לזיהוי וכימות להשלים את כולו של שומנים בתאי שמרים. השיטה המתוארת אינה דורשת הפרדה chromatographic של תערובות השומנים מורכבים התאושש מתאי השמרים, ובכך מאיץ מאוד את תהליך רכישת הנתונים. שיטה זו מאפשרת זיהוי שומנים וכימות על ריכוזים נמוך כמו גרם / מ"ל ו – יושם בהצלחה להערכת lipidomes בתאי שמרים שלם האברונים מטוהרים שלהם. ליפידים מיצוי מתאי שמרים שלם באמצעות שיטה זו של ניתוח השומנים לוקח שעתיים עד שלוש שעות. זה לוקח רק חמש עד עשר דקות לרוץ כל מדגם של שומנים חילוץ מיובשים על ספקטרומטר Q-TOF המוני מצויד מקור ננו electrospray.
Protocol
Discussion
שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית מהירה של lipidome את השמרים באמצעות זמינים, חומרים זולים. השיטה מאפשרת זיהוי של מרבית המינים השומנים המצוי בתאי שמרים למעט diacylglycerols, ergosterols ו אסטרים ergosteryl, למרות שומנים אלה ניתן לזהות על ידי החלפת הידרוקסיד עם אמוניום הידרוקסיד ליתיום. השיטה המ…
Acknowledgements
אנו מודים אלן טסייה עבור לייעץ, דיונים חשובים, ותמיכה טכנית. אנו מכירים את מרכז עבור יישומים ביולוגיים של ספקטרומטריית מסה ב אוניברסיטת קונקורדיה עבור שירותי מצטיינים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי CIHR לבין NSERC של קנדה. ויט הוא חוקר חדש CIHR ו קונקורדיה יו"ר אוניברסיטת מחקר Genomics, ביולוגיה של התא והזדקנות.
References
- Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
- Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
- Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
- Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
- Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
- Brü, g. g. e. r., Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
- Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
