Summary
אנו מתארים שיטה חדשה lipidomics כמותי לזיהוי שומנים מינים רבים שמרים באמצעות סקר סריקה יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (ESI / MS). שיטה זו עולה כיום השיטות הזמינות לזיהוי שומנים וכימות ביכולת לפתור צורות מולקולריות שונים של שומנים, רגישות, ומהירות.
Abstract
ליפידים הם אחד השיעורים הגדולים של ביומולקולות ולשחק בתפקידים חשובים הדינמיקה קרום, אחסון אנרגיה, איתות
Protocol
חומרים ושיטות
- שמרים זנים ותנאי גידול
זן wild-type BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) היה גדל בינוני YEPD עשיר (1% תמצית שמרים, peptone 2%, גלוקוז 2%). היו תאים בתרבית בשעה 30 ° C עם הסיבוב רועד בסל"ד 200 ב צלוחיות Erlenmeyer על יחס "נפח / בינוני נפח בקבוק" של 05:01. - אחסון של תאים שמרים להפקת השומנים
- תרבות 50 מ"ל של תאים נאסף על ידי צנטריפוגה XG ב 3000 במשך 5 דקות.
- לרחוץ פעמיים עם מים קרים.
- Resuspend גלולה במים קרים 25 מ"ל
- גלולה תאים בצנטריפוגה XG ב 3000 למשך 5 דקות
- Resuspend את הכדור ולהעביר Eppendorf צינור
- גלולה ידי צנטריפוגה, 16,000 XG במשך 2 דקות, להסיר supernatant ולהקפיא ב -80 ° C עד השימוש. (אנו משתמשים כוס של אלכוהול איזופרופילי ונשמרים במקפיא -80, חנקן נוזלי יכול לשמש גם)
- ריאגנטים
כלורופורם כיתה מתנול ביוטק והיו מן סיגמא אולדריץ. חומצות שומן חופשיות triacylglycerols נרכשו מ Larodan (מאלמו, שוודיה). מינים שונים של פוספוליפידים - כולל phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, חומצה phosphatidic ו cardiolipins - התקבלו ליפידים אוואנטי פולאר (אלבסטר, אל על, ארה"ב). במהירות גבוהה צנטריפוגות מבחנות זכוכית מצופה טפלון עם כובעים היו פישר.
ליפידים מיצוי
זהו שינוי של הפרוטוקול שתואר על ידי דייר בליי ו 8. מניפולציות עם כל השומנים חילוץ צריך להיעשות באמצעות טפטפות זכוכית או מזרקים, פלסטיק תיצור אות רקע גדול אם הם באים במגע עם כלורופורם. הכרכים המדויק לא קריטי כל עוד יחס של 1:2:0.8 עבור כלורופורם - MeOH - H 2 O בשלב 3 ו 2:2:1.8 עבור כלורופורם - MeOH - H 2 O בכל שלב 7 שמורים.
- Resuspend תאים קפואים 1.6 מ"ל של קר כקרח מזוקקים H 2 O.
- העברת 1.6 מ"ל של ההשעיה התא במהירות גבוהה צינורות זכוכית צנטריפוגות.
- הוסף 6 מ"ל של תערובת (01:02) כלורופורם MeOH ו 0.8 מ"ל של חרוזי זכוכית על השעיית התא.
- וורטקס ההשעיה תא עם חרוזי זכוכית פעמיים דקות 1.
- הוסף 2 מ"ל של כלורופורם ומערבבים בעדינות.
- דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם.
- הוסף 2 מ"ל של H 2 O מזוקקים ומערבבים בעדינות.
- דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר.
- שלב איסוף נוזל כולו לתוך צינור צנטריפוגות חדשות במהירות גבוהה זכוכית.
- הוסף 3.2 מ"ל של כלורופורם את כדורי תא משלב 9.
- וורטקס פעמיים דקות 1.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים את supernatant לשלב את הנוזל משלב 10.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר.
- מחק את השלב העליון (מימית) ולהעביר את התחתון (אורגני) שלב לתוך צינור צנטריפוגות חדשות במהירות גבוהה זכוכית.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר.
- מעבירים את supernatant כולו לתוך בקבוקון זכוכית יבש תחת חנקן.
- ממיסים את הסרט השומנים ב 500 μl של כלורופורם ולאחסן ב -20 ° C.
ניתוח של שומנים על ידי ספקטרומטריית מסה
תמהיל המניות של סטנדרטים השומנים בכלורופורם צריכים להיות מוכנים מראש לפי לוח 1, כמו גם פתרון המניות של MeOH - כלורופורם (1:1) עם 0.1% (V / V) אמוניום הידרוקסיד.
- לפני הזריקה, לשלב 10 μl של המדגם עם 10 μl של לערבב את רמת שומנים הניתנים בטבלה 1. ב 200μL של 01:01 כלורופורם: מתנול עם% 0.1 NH 4 OH.
- התקן יחס מדגם ניתן לשנות לפי הצורך.
- פתור שומנים באמצעות Q-TOF Micromass 2 ספקטרומטר מסה מצויד ההפעלה ננו electrospray מקור בקצב הזרימה של μl 1 / min.
- פרמטרים מכשיר מדויק ישתנה ממכשיר למכשיר. ראה טבלה 2 עבור הגדרות עבור Micromass Q-TOF 2 (ווטרס, מילפורד, מסצ'וסטס, ארה"ב) מצויד מקור ננו electrospray. למרות שאנו ניצלו ברזולוציה גבוהה מסוג Q-TOF של ספקטרומטר מסה, זה לא דרישה הכרחית.
- לאחר הרכישה הספקטרום המונית הם מוחלק, רקע ניכוי ו מרוכז, ולאחר מכן את רשימת שיא מיוצא ל-Excel. שיאים של כל שיעור השומנים הם מנורמל אז לרמת הפנימי שלהם. בהתאם ליישום, ייתכן שיהיה צורך לעשות מבצעים נוספים שלאחר עיבוד כגון deisotoping ו deconvolution.
טבלה 1. סטנדרטים השומנים פנימית, ריכוז שלהםתמהיל סטנדרטי, ואת במצב MS לניתוח שלהם.
| ליפידים בכיתה | שרשרת רגילה הרכב | המוניים של תקן | ריכוז (מיקרוגרם / מ"ל) | MS מצב |
| Phosphatidic חומצה | 14:0 / 14:0 | 591.40 | 100 | שלילי |
| Phosphatidylethanolamine | 14:0 / 14:0 | 634.45 | 200 | שלילי |
| Phosphatidylinositol | N / A | N / A | N / A | שלילי |
| Phosphatidylserine | 14:0 / 14:0 | 622.37 | 40 | שלילי |
| Cardiolipin | 4x14: 0 | 619.92 | 100 | שלילי |
| חומצות שומן חינם | 19:00 | 297.28 | 100 | שלילי |
| Phosphatidylcholine | 14:0 / 14:0 | 650.48 | 100 | חיובי |
| Triacylglycerols | 13:0 / 13:0 / 13:0 | 698.63 | 200 | חיובי |
טבלה 2. הגדרות מכשיר Micromass Q-TOF 2 (ווטרס, מילפורד, מסצ'וסטס, ארה"ב) מצויד מקור ננו electrospray.
| תזרים קצב | קון מתח | נימי מתח | התנגשות גז | |
| מצב חיובי | 1μl/min | V -28 | 3.0 kv | 10 |
| מצב שלילי | 1μl/min | 30 v | -3.2 Kv | 10 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית מהירה של lipidome את השמרים באמצעות זמינים, חומרים זולים. השיטה מאפשרת זיהוי של מרבית המינים השומנים המצוי בתאי שמרים למעט diacylglycerols, ergosterols ו אסטרים ergosteryl, למרות שומנים אלה ניתן לזהות על ידי החלפת הידרוקסיד עם אמוניום הידרוקסיד ליתיום. השיטה המתוארת מאפשרת זיהוי שומנים וכימות על ריכוזים נמוך כמו מיקרוגרם / מ"ל, עם ליניאריות הריכוז המתפשט על 2-3 סדרי גודל (בהתאם למין שומנים בדם). אף על פי הסטנדרטים המתאימים phosphatidylinositol אינם זמינים מסחרית, צורות מולקולריות שונות של פוספוליפידים זה ניתן להעריך באמצעות סטנדרטים פוספוליפידים מינים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים אלן טסייה עבור לייעץ, דיונים חשובים, ותמיכה טכנית. אנו מכירים את מרכז עבור יישומים ביולוגיים של ספקטרומטריית מסה ב אוניברסיטת קונקורדיה עבור שירותי מצטיינים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי CIHR לבין NSERC של קנדה. ויט הוא חוקר חדש CIHR ו קונקורדיה יו"ר אוניברסיטת מחקר Genomics, ביולוגיה של התא והזדקנות.
References
- Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
- Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
- Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
- Russell, S. J., Kahn, C. R.
- Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
- Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
- Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
