Summary
我们描述了一个新的定量确定使用调查的扫描电喷雾电离质谱（ESI / MS）酵母大量的脂质物种lipidomics方法。这种方法超过目前可用的方法脂质识别和量化的能力来解决血脂，灵敏度和速度不同的分子形式。
Abstract
脂质是生物分子的主要类别之一，并发挥重要作用膜动力学，能量存储，和信令
Protocol
材料和方法
- 酵母菌株和生长条件。
丰富YEPD培养基中生长的野生型菌株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0）（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖） 。细胞培养在30 ° C旋转摇晃锥形瓶在200 RPM“瓶体积/中等音量”5:1的比例。 - 脂质提取的酵母细胞储存
- 文化是收获的细胞50毫升离心5分钟在3000 XG。
- 用冷水冲洗两次。
- 悬浮颗粒在25毫升冰水
- 在离心沉淀细胞，5分钟在3000 XG
- 悬浮颗粒和转移到Eppendorf管
- 球离心，16000 XG 2分钟，取出使用上清于-80 ° C，直到和冻结。 （我们使用异丙醇的烧杯中，也可以用液态氮保存在-80冷冻）
- 试剂
自Sigma - Aldrich生物技术级氯仿和甲醇。游离脂肪酸和甘油三酯均购自Larodan（瑞典马尔默）。获得各种种磷脂 - 包括磷脂，磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，并cardiolipins - 阿凡提极性脂（雪花石膏，AL，美国）。从费舍尔高速离心管玻璃与聚四氟乙烯内衬的盖子。
脂质提取
这是一个布莱和代尔8所述的协议的修改。提取血脂所有的操作，应使用玻璃移液管或注射器，塑料将创建一个大的背景信号，如果他们接触到，以氯仿。确切的卷是不是只要关键氯仿的比例为1:2:0.8 -甲醇-在第3步中的H 2 O和2:2:1.8为氯仿-甲醇- H 2 O在第7步是保守的。
- 冷冻细胞重悬在1.6毫升的冰冷的蒸馏水H 2 O
- 1.6毫升细胞悬液转移到高速的玻璃离心管。
- 加入6毫升氯仿和甲醇（1:2）混合和0.8毫升细胞悬液的玻璃珠。
- 涡细胞悬液，用玻璃珠1分钟的2倍。
- 加入2毫升氯仿，轻轻混匀。
- 孵育5分钟室温搅拌偶尔。
- 加入2毫升的蒸馏水H 2 O，轻轻混匀。
- 孵育5分钟室温搅拌偶尔。
- 在3000 XG在室温下5分钟离心。
- 整个液相收集到一个新的高速玻璃离心管。
- 从第9步的细胞沉淀，加入3.2毫升氯仿。
- 涡1分钟两次。
- 在3000 XG在室温下5分钟离心。
- 从第10步液相添加上清。
- 在3000 XG在室温下5分钟离心。
- 倒掉上层（水）相和较低的阶段（有机）转移到一个新的高速玻璃离心管。
- 在3000 XG在室温下5分钟离心。
- 整个上清转移到一个玻璃小瓶，干燥的氮气保护下。
- 脂质膜溶解于500μL氯仿和储存在-20 ° C
质谱分析血脂
血脂标准的股票组合中的氯仿应事先准备好的，按表1，以及原液的甲醇 - 氯仿（1:1）0.1％（V / V）氢氧化铵。
- 注射前，结合10μL在表1提供的血脂标准混合样品10μL。在200μL1:1的氯仿：甲醇与0.1％NH 4 OH。
- 样本比例的标准是可以改变的需要。
- 解决使用一个微团的Q - TOF质谱仪配备与1μL/ min的流速在纳米电源经营血脂。
- 从仪器仪表精确的仪器参数会有所不同。一个微团配备一个纳米电源2 Q - TOF（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州，美国）的设置，请参阅表2。虽然我们已采取的Q - TOF质谱仪的一个类型的高分辨率的优势，它不是一种强制性要求。
- 收购后的质谱是平滑的，减去背景和中心，然后高峰列表导出到Excel。每个脂质类的峰值，然后归到他们的内部标准。根据不同的应用，它可能需要做进行进一步处理后deisotoping和反褶积等。
表1。内部血脂标准，其浓度标准的组合，并为他们的分析MS模式。
| 脂质类 | 标准链的构成 | 标准的质量 | 浓度（微克/毫升） | MS模式 |
| 磷脂酸 | 14:0 / 14:0 | 591.40 | 100 | 负面 |
| 磷脂酰乙醇胺 | 14:0 / 14:0 | 634.45 | 200 | 负面 |
| 磷脂 | N / A | N / A | N / A | 负面 |
| 磷脂 | 14:0 / 14:0 | 622.37 | 40 | 负面 |
| 心磷脂 | 4x14：0 | 619.92 | 100 | 负面 |
| 游离脂肪酸 | 19:0 | 297.28 | 100 | 负面 |
| 卵磷脂 | 14:0 / 14:0 | 650.48 | 100 | 积极的 |
| 甘油三酯 | 13:0 / 13:0 / 13:0 | 698.63 | 200 | 积极的 |
表2。一个微团Q - TOF 2（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州，美国）的仪器设置配备纳米电源。
| 流量 | 锥孔电压 | 毛细管电压 | 碰撞气体 | |
| 正离子模式 | 1μl/min | -28 v | 3.0 KV | 10 |
| 负离子模式 | 1μl/min | 30 V | -3.2 KV | 10 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这种方法使酵母lipidome使用现成的，廉价的材料的快速定量评估。该方法允许大部分diacylglycerols，ergosterols和ergosteryl酯的例外在酵母细胞中发现的脂质物种的鉴定，虽然这些脂质可取代氢氧化锂，氢氧化铵确定。所描述的方法可低至微克/毫升的浓度脂质识别和量化，与浓度的线性超过2〜3个数量级（脂质种而定）的蔓延。虽然市售磷酸肌醇的适当的标准，本磷脂不同的分子形式可以使用其他磷脂物种的标准进行评估。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
我们非常感谢阿兰特西尔宝贵的建议，讨论和技术支持。我们承认在Concordia大学生物应用质谱杰出服务中心。这项工作得到了CIHR和加拿大NSERC资助。 VIT是一个新的CIHR调查和Concordia大学基因组学研究主席，细胞生物学和老化。
References
- Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
- Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
- Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
- Russell, S. J., Kahn, C. R.
- Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
- Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
- Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
