A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Summary

Descrevemos um novo método lipidomics quantitativos para identificação de espécies de lipídios numerosos em levedura utilizando pesquisa scan-espectrometria de massa de ionização electrospray (ESI / MS). Este método ultrapassa atualmente os métodos disponíveis para identificação e quantificação de lipídios na capacidade de resolver diversas formas moleculares de lipídeos, sensibilidade e velocidade.

Abstract

Lipídios são uma das principais classes de biomoléculas e jogar papéis importantes membrana dinâmica, armazenamento de energia, e sinalização^04/01. A levedura de brotamento<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Uma geneticamente e bioquimicamente eukaryote manipuláveis ​​unicelulares com genoma anotado e lipidome muito simples, é um modelo valioso para estudar as funções biológicas das espécies de vários lipídios em eucariotos multicelulares^2,3,5.<em> S. cerevisiae</em> Tem 10 principais classes de lipídios, principalmente com comprimentos de cadeia de 16 ou 18 átomos de carbono e zero ou um grau de insaturação^6,7. Métodos existentes para a identificação e quantificação de lipídeos – como a cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia em camada fina, microscopia de fluorescência, cromatografia gasosa e seguido por MS – está bem estabelecida, mas apresentam baixa sensibilidade, insuficientemente separar várias formas moleculares de lípides, requerem derivitization lipídica antes para análise, ou pode ser bastante demorado. Aqui nós apresentamos uma descrição detalhada da nossa abordagem experimental para resolver essas limitações inerentes usando pesquisa scan-ESI / MS para a identificação e quantificação do complemento inteiro de lipídios em células de levedura. O método descrito não necessita de separação cromatográfica de misturas complexas de lipídios recuperados a partir de células de levedura, assim grandemente acelerar o processo de aquisição de dados. Este método permite a identificação e quantificação de lipídios nas concentrações tão baixo quanto g / ml e tem sido aplicado com sucesso para avaliar lipidomes de células de levedura todo e suas organelas purificada. Lipídios extração de células de levedura todo para usar este método de análise de lipídios leva de duas a três horas. Leva apenas 9:55 minutos para executar cada amostra de lipídios extraídos e secos em um espectrômetro de massa Q-TOF equipado com uma fonte de nano-electrospray.

Protocol

Materiais e métodos Cepas de leveduras e condições de crescimento A cepa do tipo selvagem BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) foi cultivado em meio YEPD rica (1% extrato de levedura, peptona 2%, 2% de glicose). Células foram cultivadas a 30 ° C com rotação agitação a 200 rpm em Erlenmeyers em um "volume frasco de volume / médio" proporção de 5:1. Armazenamento de células de levedura para extração de lipídios Uma cultura de 50 ml de …

Discussion

Este método permite uma rápida avaliação quantitativa do lipidome levedura utilizando prontamente disponíveis, materiais mais baratos. O método permite a identificação da maioria das espécies de lipídios encontrados em células de levedura com exceção de diacilgliceróis, ergosterols e ésteres ergosteryl, embora estes lipídios podem ser identificados através da substituição de hidróxido de amônio com hidróxido de lítio. O método descrito permite a identificação e quantificação de lipídios nas …