Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

doi: 10.3791/1513 Published: August 21, 2009

Summary

Wir beschreiben eine neue quantitative Lipidomik Methode zur Identifizierung zahlreicher Lipidspezies in Hefe mit Umfrage-scan Elektrospray Massenspektrometrie (ESI / MS). Diese Methode überschreitet derzeit verfügbaren Methoden für die Lipid-Identifizierung und Quantifizierung in der Fähigkeit, verschiedene molekulare Formen von Lipiden, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit zu lösen.

Abstract

Lipide sind eine der wichtigsten Klassen von Biomolekülen und spielen eine wichtige Rolle Membran Dynamik, Energiespeicherung und-Signalisierung

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Material und Methoden

  1. Hefestämme und Wachstumsbedingungen
    Der Wildtypstamm BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) wurde in den reichen YEPD Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose). Die Zellen wurden bei 30 ° C mit Rotations-Schütteln bei 200 rpm in Erlenmeyer-Kolben bei einer "Flasche Volumen / Medium Volume"-Verhältnis von 5:1 kultiviert.
  2. Lagerung von Hefezellen zur Lipidextraktion
    1. Eine 50 ml Kultur von Zellen wurde durch Zentrifugation bei 3000 xg für 5 Minuten geerntet.
    2. Zweimal mit kaltem Wasser.
      1. Pellet in 25 ml eiskaltem Wasser
      2. Pellet-Zellen in der Zentrifuge bei 3000 xg für 5 Minuten
    3. Das Pellet und Transfer zum Eppendorf-Röhrchen
    4. Pellet durch Zentrifugation, 16.000 xg für 2 Minuten, Überstand entfernen und frieren bei -80 ° C bis zur Verwendung. (Wir verwenden ein Becherglas mit Isopropylalkohol gehalten in dem -80 Gefrierschrank, flüssigem Stickstoff können ebenfalls verwendet werden)
  3. Reagenzien
    Biotech grade Chloroform und Methanol wurden von Sigma-Aldrich. Freie Fettsäuren und Triglyzeriden wurden aus Larodan (Malmö, Schweden) bezogen. Verschiedene Arten von Phospholipiden - einschließlich Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure und Cardiolipine - wurden von Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA) erhalten. High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen mit Teflon ausgekleideten Kappen wurden von Fisher.

Lipidextraktion

Dies ist eine Modifikation des Protokolls durch Bligh und Dyer 8 beschrieben. Alle Manipulationen mit extrahierten Lipide sollte mit Glas Pipetten oder Spritzen werden; Kunststoffen eine große Hintergrund-Signal zu erzeugen, wenn sie in Kontakt mit Chloroform zu kommen. Die genauen Mengen sind nicht kritisch, solange die Verhältnisse der 1:2:0.8 für Chloroform - Methanol - H 2 O in Schritt 3 und 2:2:1.8 für Chloroform - Methanol - H 2 O in Schritt 7 konserviert sind.

  1. Resuspendieren gefrorenen Zellen in 1,6 ml eiskaltem destilliertem H 2 O.
  2. Übertragen 1,6 ml der Zellsuspension zu High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen.
  3. Add 6 ml Chloroform und MeOH (1:2) mischen und 0,8 ml Glasperlen zur Zellsuspension.
  4. Vortex die Zellsuspension mit Glasperlen zweimal für 1 min.
  5. 2 ml Chloroform und vorsichtig mischen.
  6. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen.
  7. 2 ml destilliertem H 2 O und vorsichtig mischen.
  8. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen.
  9. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
  10. Sammeln Sie die gesamte flüssige Phase in ein neues High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen.
  11. Fügen Sie 3,2 ml Chloroform auf die Zellpellets aus Schritt 9.
  12. Vortex zwei Mal für 1 min.
  13. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
  14. Fügen Sie den Überstand in der flüssigen Phase aus Schritt 10.
  15. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
  16. Entsorgen Sie die obere (wässrige) Phase und übertragen Sie die untere (organische) Phase in ein neues High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen.
  17. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
  18. Geben Sie den gesamten Überstand in einem Glasfläschchen und trocken unter Stickstoff.
  19. Lösen Sie den Lipidfilm in 500 ul Chloroform und bei -20 ° C.

Analyse von Lipiden durch Massenspektrometrie

Chloroform (1:1) mit 0,1% (v / v) Ammoniumhydroxid - Eine Aktie Mischung aus Lipid-Standards in Chloroform sollte vorher gemäß Tabelle 1 sowie einer Stammlösung von MeOH vorbereitet werden.

  1. Vor der Injektion kombinieren 10 ul einer Probe mit 10 ul der üblichen Mischung von Lipiden in Tabelle 1 angegeben. In 200 ul von 1:1 Chloroform: Methanol mit 0,1% NH 4 OH.
    • Der Standard zur Probe Verhältnis kann bei Bedarf geändert werden.
  2. Resolve Lipide mit einem Micromass Q-TOF 2 Massen-Spektrometer mit einem Nano-Elektrospray-Source-Betriebssystem mit einer Flussrate von 1 ml / min ausgestattet.
    • Exact Geräteparameter wird von Instrument zu Instrument unterschiedlich sein. Siehe Tabelle 2 für die Einstellungen für eine Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) mit einem Nano-Elektrospray-Quelle ausgestattet. Obwohl wir den Vorteil der hohen Auflösung eines Q-TOF Art von Massenspektrometer aufgenommen haben, ist es nicht zwingend erforderlich.
  3. Nach dem Erwerb der Massenspektren werden geglättet, Hintergrund subtrahiert und zentriert, und dann die Peak-Liste nach Excel exportiert. Die Spitzen der einzelnen Lipid-Klasse werden dann in ihre internen Standard normalisiert. Je nach Anwendung kann es notwendig sein, nicht weiter Nachbearbeitung wie deisotoping und Entfaltung führen.

Tabelle 1. Internal Lipid-Standards, deren Konzentrationen inder Standard-Mix und die MS-Modus für deren Analyse.

Lipid-Klasse Standard-Kette Zusammensetzung Masse der Standard- Konzentration (pg / ml) MS-Modus
Phosphatidsäure 14:0 / 14:0 591,40 100 Negativ
Phosphatidylethanolamin 14:0 / 14:0 634,45 200 Negativ
Phosphatidylinositol N / A N / A N / A Negativ
Phosphatidylserin 14:0 / 14:0 622,37 40 Negativ
Cardiolipin 4x14: 0 619,92 100 Negativ
Freie Fettsäuren 19.00 297,28 100 Negativ
Phosphatidylcholin 14:0 / 14:0 650,48 100 Positiv
Triacylglycerole 13:0 / 13:0 / 13:0 698,63 200 Positiv

Tabelle 2. Geräteeinstellungen für eine Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) mit einem Nano-Elektrospray-Quelle ausgestattet.

Durchfluss Cone-Spannung Kapillar-Spannung Stoßgas
Positive Modus 1μl/min 28V 3,0 kV 10
Negative Modus 1μl/min 30 v -3,2 Kv 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Diese Methode ermöglicht eine schnelle quantitative Beurteilung der Hefe lipidome mit leicht verfügbaren, preiswerten Materialien. Die Methode erlaubt die Identifikation der meisten Lipidspezies in Hefezellen mit Ausnahme der Diacylglycerole, ergosterols und ergosteryl Ester gefunden, obwohl diese Lipide durch den Austausch Ammoniumhydroxid mit Lithiumhydroxid identifiziert werden kann. Das beschriebene Verfahren ermöglicht Lipid Identifizierung und Quantifizierung der Konzentrationen so niedrig wie pg / ml, wobei die Konzentration Linearität die sich über 2 bis 3 Größenordnungen (abhängig von Lipid-Arten). Obwohl angemessene Standards für die Phosphatidylinositol nicht kommerziell erhältlich sind, können die verschiedenen molekularen Formen dieses Phospholipid beurteilt unter Verwendung von Standards für andere Phospholipid Spezies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wir sind dankbar, dass Alain Tessier für wertvolle Beratung, Diskussionen und technische Unterstützung. Wir erkennen das Zentrum für Biologische Anwendungen der Massenspektrometrie an der Concordia University für herausragende Leistungen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem CIHR und der NSERC of Canada unterstützt. VIT ist ein CIHR New Investigator und Concordia University Research Chair in Genomics, Cell Biology and Aging.

References

  1. Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
  2. Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
  3. Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
  4. Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
  5. Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
  6. Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
  7. Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
  8. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).More

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter