Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En kvantitativ bedömning av jästen Lipidome med elektrospray Spektrometri jonisation

doi: 10.3791/1513 Published: August 21, 2009

Summary

Vi beskriver en ny kvantitativ lipidomics metod för att identifiera många lipid arter i jäst med hjälp av enkät-scan elektrospray spektrometri jonisation (ESI / MS). Denna metod överstiger tillgängliga metoder för lipid identifiering och kvantifiering av förmågan att lösa olika molekylära former av lipider, känslighet och snabbhet.

Abstract

Lipider är en av de större grupper av biomolekyler och spelar viktiga roller membran dynamik, energilagring, och signalering

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Material och metoder

  1. Jäststammar och villkor tillväxt
    Den vildtyp stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) odlades i rika YEPD medelhög (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos). Cellerna odlades vid 30 ° C med roterande skaka vid 200 rpm i E-kolvar på en "kolv volym / medelhög volym" förhållandet 5:1.
  2. Lagring av jästceller för extraktionen av fettet
    1. En 50 ml kultur av celler har skördats genom centrifugering vid 3000 xgi 5 minuter.
    2. Tvättas två gånger med kallt vatten.
      1. Resuspendera pelleten i 25 ml iskallt vatten
      2. Pellets celler i centrifugera vid 3000 xg under 5 minuter
    3. Suspendera pelleten och transfer till Eppendorf-rör
    4. Pellets genom centrifugering, 16.000 xgi 2 minuter, ta bort supernatanten och frys vid -80 ° C fram till användning. (Vi använder en bägare av isopropylalkohol förvaras i -80 frys, kan flytande kväve också användas)
  3. Reagenser
    Biotech klass kloroform och metanol var från Sigma-Aldrich. Fria fettsyror och triacylglyceroler köptes från Larodan (Malmö, Sverige). Olika arter av fosfolipider - inklusive fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylinositol, fosfatidylserin, fosfatinsyra, och cardiolipins - erhölls från Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA). Snabb glas centrifugrör med Teflon fodrade mössor var från Fisher.

Lipid utvinning

Detta är en modifiering av det protokoll som beskrivs av Bligh och Dyer 8. Alla manipulationer med extraherade lipider ska göras med glaspipetter eller sprutor, plast kommer att skapa en stor bakgrund signal om de kommer i kontakt med kloroform. De exakta volymerna är inte kritisk så länge förhållandet mellan 1:2:0.8 för kloroform - MeOH - H 2 O i steg 3 och 2:2:1.8 för kloroform - MeOH - H 2 O i steg 7 bevaras.

  1. Resuspendera frusna cellerna i 1,6 ml iskall destillerat H 2 O.
  2. Överför 1,6 ml av cellsuspension till snabba glasrör centrifugen.
  3. Tillsätt 6 ml kloroform och MeOH (1:2) blandning och 0,8 ml av glaspärlor till cellsuspension.
  4. Vortex cellsuspensionen med glaspärlor två gånger i 1 min.
  5. Tillsätt 2 ml kloroform och blanda försiktigt.
  6. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur med enstaka blandning.
  7. Tillsätt 2 ml destillerat H 2 O och blanda försiktigt.
  8. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur med enstaka blandning.
  9. Centrifugera i 5 min vid 3000 xg vid rumstemperatur.
  10. Samla hela vätskefasen in i en ny hög hastighet glas centrifugrör.
  11. Tillsätt 3,2 ml kloroform till den cell pellets från steg 9.
  12. Vortex två gånger i 1 min.
  13. Centrifugera i 5 min vid 3000 xg vid rumstemperatur.
  14. Lägg supernatanten till vätskefasen från steg 10.
  15. Centrifugera i 5 min vid 3000 xg vid rumstemperatur.
  16. Kasta den övre (vatten) fasen och överföra den lägre (organiska) fasen till en ny hög hastighet glas centrifugrör.
  17. Centrifugera i 5 min vid 3000 xg vid rumstemperatur.
  18. Överför hela supernatanten i en glasflaska och torka under kväve.
  19. Lös lipid filmen i 500 l av kloroform och förvara vid -20 ° C.

Analys av lipider med masspektrometri

Ett lager mix av lipid-standarder i kloroform bör förberedas i förväg enligt tabell 1, samt en stamlösning av MeOH - kloroform (1:1) med 0,1% (v / v) ammoniumhydroxid.

  1. Före injektion, kombinera 10 ìl av ett prov med 10 ìl av standarden blandning av lipider i tabell 1. I 200μL på 1:1 kloroform: metanol med 0,1% NH 4 OH.
    • Standarden för att provkvot kan ändras efter behov.
  2. Lösa lipider med hjälp av en Micromass Q-TOF 2 masspektrometer försedd med en nano-elektrospray källa som arbetar på ett flöde på 1 l / min.
    • Exakt instrument parametrar kommer att variera från instrument till instrument. Se tabell 2 för inställningar för en Micromass Q-TOF-2 (Vatten, Milford, MA, USA) utrustad med en nano-elektrospray källa. Även om vi har dragit nytta av den höga upplösningen av en Q-TOF typ av masspektrometer, är det inte ett obligatoriskt krav.
  3. Efter förvärvet massan spektra jämnas, bakgrund subtraheras och centrerad, och sedan topp listan exporteras till Excel. Den toppar på varje lipid klass sedan normaliseras till sin inre standard. Beroende på program, kan det vara nödvändigt att enbart utföra ytterligare efterbearbetning såsom deisotoping och deconvolution.

Tabell 1. Intern lipid normer, deras koncentrationer istandard mix och MS-läge för deras analys.

Lipid klass Standard kedja sammansättning Massa av standard Koncentration (mikrogram / ml) MS-läge
Fosfatinsyra 14:0 / 14:0 591,40 100 Negativ
Fosfatidyletanolamin 14:0 / 14:0 634,45 200 Negativ
Fosfatidylinositol N / A N / A N / A Negativ
Fosfatidylserin 14:0 / 14:0 622,37 40 Negativ
Kardiolipin 4x14: 0 619,92 100 Negativ
Fria fettsyror 19:00 297,28 100 Negativ
Fosfatidylkolin 14:0 / 14:0 650,48 100 Positiv
Triacylglyceroler 13:0 / 13:0 / 13:0 698,63 200 Positiv

Tabell 2. Instrument inställningar för en Micromass Q-TOF-2 (Vatten, Milford, MA, USA) utrustad med en nano-elektrospray källa.

Flöde Cone spänning Kapillär spänning Kollision gas
Positiva läge 1μl/min -28 V 3,0 kv 10
Negativ-läge 1μl/min 30 v -3,2 Kv 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna metod möjliggör en snabb kvantitativ bedömning av jästen lipidome med lättillgängliga, billiga material. Metoden gör det möjligt att identifiera de flesta av lipid arter som finns i jästceller, med undantag av diglycerider, ergosterols och ergosteryl estrar, även om dessa lipider kan identifieras genom att ersätta ammoniumhydroxid med litiumhydroxid. Den beskrivna metoden kan lipid identifiering och kvantifiering vid så låga koncentrationer som mikrogram / ml, med koncentrationen linjäritet sprids under 2 till 3 tiopotenser (beroende på lipid arter). Även om lämpliga normer för fosfatidylinositol inte är kommersiellt tillgängliga kan de olika molekylära former av denna fosfolipid bedömas med hjälp av standarder för andra fosfolipid arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för Alain Tessier för värdefulla råd, diskussioner och teknisk support. Vi erkänner Centrum för biologiska tillämpningar av masspektrometri vid Concordia University för framstående tjänster. Detta arbete har finansierats med bidrag från CIHR och NSERC av Kanada. VIT är en CIHR ny undersökare och Concordia University forskning ordförande i genomik, cellbiologi och åldrande.

References

  1. Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
  2. Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
  3. Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
  4. Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
  5. Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
  6. Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
  7. Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
  8. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
En kvantitativ bedömning av jästen Lipidome med elektrospray Spektrometri jonisation
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).More

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter