Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

Summary

Descriviamo un nuovo metodo quantitativo per l'identificazione lipidomica numerose specie lipidico nel lievito con sondaggio-scan ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI / MS). Questo metodo supera attualmente i metodi disponibili per l'identificazione e la quantificazione dei lipidi nella capacità di risolvere le varie forme molecolari dei lipidi, la sensibilità e la velocità.

Abstract

I lipidi sono una delle principali classi di biomolecole e giocare ruoli importanti membrana dinamica, immagazzinamento di energia, e la segnalazione^1-4. Il lievito in erba<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Un organismo geneticamente e biochimicamente eucarioti unicellulari manipolabili con genoma annotati e lipidome molto semplice, è un modello valido per studiare le funzioni biologiche di specie diverse di lipidi negli eucarioti pluricellulari^2,3,5.<em> S. Saccharomyces</em> Ha 10 principali classi di lipidi di lunghezza catena principalmente di 16 o 18 atomi di carbonio e uno o nessun grado di insaturazione^6,7. Gli attuali metodi per l'identificazione e quantificazione dei lipidi – come la cromatografia liquida ad alte prestazioni, cromatografia su strato sottile, microscopia a fluorescenza, e gas-cromatografia seguita da MS – sono ben stabiliti, ma hanno una bassa sensibilità, le varie forme sufficientemente separati molecolari dei lipidi, richiedono derivitization lipidi prima di analisi, o può essere abbastanza tempo. Presentiamo qui una descrizione dettagliata del nostro approccio sperimentale per risolvere queste limitazioni intrinseche tramite sondaggio-scan ESI / MS per l'identificazione e la quantificazione del complemento di tutto di lipidi nelle cellule di lievito. Il metodo descritto non richiede la separazione cromatografica di miscele di lipidi complessi recuperato da cellule di lievito, quindi notevolmente accelerare il processo di acquisizione dei dati. Questo metodo consente l'identificazione e quantificazione dei lipidi alle concentrazioni più basso g / ml ed è stato applicato con successo per valutare lipidomes di cellule di lievito e tutto il loro organelli purificato. Estrazione di lipidi da cellule di lievito tutto per l'utilizzo di questo metodo di analisi dei lipidi richiede da due a tre ore. Ci vogliono solo 5-10 minuti per eseguire ogni campione di lipidi estratti e secca su un Q-TOF spettrometro di massa dotata di un nano-elettrospray fonte.

Protocol

Materiali e metodi Ceppi di lievito e le condizioni di crescita Il ceppo selvatico BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) era cresciuto in media ricca YEPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di glucosio). Le cellule sono state coltivate a 30 ° C con agitazione di rotazione a 200 rpm in beute con un rapporto "fiasco volume / medio volume" di 5:1. Stoccaggio di cellule di lievito per l'estrazione dei lipidi Una cultura da 50 ml di cellule è s…

Discussion

Questo metodo consente una rapida valutazione quantitativa del lipidome lievito utilizzando prontamente disponibili, materiali poco costosi. Il metodo permette l'identificazione della maggior parte delle specie di lipidi si trovano in cellule di lievito con l'eccezione di diacilgliceroli, ergosteroli ergosteryl ed esteri, anche se questi lipidi possono essere identificati sostituendo idrossido di ammonio e di idrossido di litio. Il metodo descritto permette l'identificazione e quantificazione dei lipidi alle…