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Biology

一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

doi: 10.3791/1513 Published: August 21, 2009

Summary

我们描述了一个新的定量确定使用调查的扫描电喷雾电离质谱(ESI / MS)酵母大量的脂质物种lipidomics方法。这种方法超过目前可用的方法脂质识别和量化的能力来解决血脂,灵敏度和速度不同的分子形式。

Abstract

脂质是生物分子的主要类别之一,并发挥重要作用膜动力学,能量存储,和信令

Protocol

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材料和方法

  1. 酵母菌株和生长条件。
    丰富YEPD培养基中生长的野生型菌株BY4742(MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0)(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖) 。细胞培养在30 ° C旋转摇晃锥形瓶在200 RPM“瓶体积/中等音量”5:1的比例。
  2. 脂质提取的酵母细胞储存
    1. 文化是收获的细胞50毫升离心5分钟在3000 XG。
    2. 用冷水冲洗两次。
      1. 悬浮颗粒在25毫升冰水
      2. 在离心沉淀细胞,5分钟在3000 XG
    3. 悬浮颗粒和转移到Eppendorf管
    4. 球离心,16000 XG 2分钟,取出使用上清于-80 ° C,直到和冻结。 (我们使用异丙醇的烧杯中,也可以用液态氮保存在-80冷冻)
  3. 试剂
    自Sigma - Aldrich生物技术级氯仿和甲醇。游离脂肪酸和甘油三酯均购自Larodan(瑞典马尔默)。获得各种种磷脂 - 包括磷脂,磷脂,磷脂酰肌醇,磷脂酰丝氨酸,磷脂酸,并cardiolipins - 阿凡提极性脂(雪花石膏,AL,美国)。从费舍尔高速离心管玻璃与聚四氟乙烯内衬的盖子。

脂质提取

这是一个布莱和代尔8所述的协议的修改。提取血脂所有的操作,应使用玻璃移液管或注射器,塑料将创建一个大的背景信号,如果他们接触到,以氯仿。确切的卷是不是只要关键氯仿的比例为1:2:0.8 -甲醇-在第3步中的H 2 O和2:2:1.8为氯仿-甲醇- H 2 O在第7步是保守的。

  1. 冷冻细胞重悬在1.6毫升的冰冷的蒸馏水H 2 O
  2. 1.6毫升细胞悬液转移到高速的玻璃离心管。
  3. 加入6毫升氯仿和甲醇(1:2)混合和0.8毫升细胞悬液的玻璃珠。
  4. 涡细胞悬液,用玻璃珠1分钟的2倍。
  5. 加入2毫升氯仿,轻轻混匀。
  6. 孵育5分钟室温搅拌偶尔。
  7. 加入2毫升的蒸馏水H 2 O,轻轻混匀。
  8. 孵育5分钟室温搅拌偶尔。
  9. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
  10. 整个液相收集到一个新的高速玻璃离心管。
  11. 从第9步的细胞沉淀,加入3.2毫升氯仿。
  12. 涡1分钟两次。
  13. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
  14. 从第10步液相添加上清。
  15. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
  16. 倒掉上层(水)相和较低的阶段(有机)转移到一个新的高速玻璃离心管。
  17. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
  18. 整个上清转移到一个玻璃小瓶,干燥的氮气保护下。
  19. 脂质膜溶解于500μL氯仿和储存在-20 ° C

质谱分析血脂

血脂标准的股票组合中的氯仿应事先准备好的,按表1,以及原液的甲醇 - 氯仿(1:1)0.1%(V / V)氢氧化铵。

  1. 注射前,结合10μL在表1提供的血脂标准混合样品10μL。在200μL1:1的氯仿:甲醇与0.1%NH 4 OH。
    • 样本比例的标准是可以改变的需要。
  2. 解决使用一个微团的Q - TOF质谱仪配备与1μL/ min的流速在纳米电源经营血脂。
    • 从仪器仪表精确的仪器参数会有所不同。一个微团配备一个纳米电源2 Q - TOF(沃特斯,米尔福德,马萨诸塞州,美国)的设置,请参阅表2。虽然我们已采取的Q - TOF质谱仪的一个类型的高分辨率的优势,它不是一种强制性要求。
  3. 收购后的质谱是平滑的,减去背景和中心,然后高峰列表导出到Excel。每个脂质类的峰值,然后归到他们的内部标准。根据不同的应用,它可能需要做进行进一步处理后deisotoping和反褶积等。

表1。内部血脂标准,其浓度标准的组合,并为他们的分析MS模式。

脂质类标准链的构成标准的质量浓度(微克/毫升) MS模式
磷脂酸 14:0 / 14:0 591.40 100 负面
磷脂酰乙醇胺 14:0 / 14:0 634.45 200 负面
磷脂 N / A N / A N / A 负面
磷脂 14:0 / 14:0 622.37 40 负面
心磷脂 4x14:0 619.92 100 负面
游离脂肪酸 19:0 297.28 100 负面
卵磷脂 14:0 / 14:0 650.48 100 积极的
甘油三酯 13:0 / 13:0 / 13:0 698.63 200 积极的

表2。一个微团Q - TOF 2(沃特斯,米尔福德,马萨诸塞州,美国)的仪器设置配备纳米电源。

流量锥孔电压毛细管电压碰撞气体
正离子模式 1μl/min -28 v 3.0 KV 10
负离子模式 1μl/min 30 V -3.2 KV 10

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Discussion

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这种方法使酵母lipidome使用现成的,廉价的材料的快速定量评估。该方法允许大部分diacylglycerols,ergosterols和ergosteryl酯的例外在酵母细胞中发现的脂质物种的鉴定,虽然这些脂质可取代氢氧化锂,氢氧化铵确定。所描述的方法可低至微克/毫升的浓度脂质识别和量化,与浓度的线性超过2〜3个数量级(脂质种而定)的蔓延。虽然市售磷酸肌醇的适当的标准,本磷脂不同的分子形式可以使用其他磷脂物种的标准进行评估。

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Acknowledgments

我们非常感谢阿兰特西尔宝贵的建议,讨论和技术支持。我们承认在Concordia大学生物应用质谱杰出服务中心。这项工作得到了CIHR和加拿大NSERC资助。 VIT是一个新的CIHR调查和Concordia大学基因组学研究主席,细胞生物学和老化。

References

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Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).More

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).

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