אנו מתארים שיטה חדשה lipidomics כמותי לזיהוי שומנים מינים רבים שמרים באמצעות סקר סריקה יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (ESI / MS). שיטה זו עולה כיום השיטות הזמינות לזיהוי שומנים וכימות ביכולת לפתור צורות מולקולריות שונים של שומנים, רגישות, ומהירות.
Abstract
ליפידים הם אחד השיעורים הגדולים של ביומולקולות ולשחק בתפקידים חשובים הדינמיקה קרום, אחסון אנרגיה, איתות<sup> 1-4</sup>. שמרים ניצני<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Eukaryote גנטית ביוכימית unicellular manipulable עם הגנום המבואר ו lipidome פשוט מאוד, הוא מודל יקר ערך לחקר תפקודים ביולוגיים של מינים השומנים השונים תאיים אאוקריוטים<sup> 2,3,5</sup>.<em> ס cerevisiae</em> יש 10 סוגים עיקריים של שומנים עם אורכי שרשרת בעיקר של 16 או 18 אטומי פחמן או אפס או אחד מידת unsaturation<sup> 6,7</sup>. השיטות הקיימות לזיהוי שומנים וכימות – כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, רזה שכבת כרומטוגרפיה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וכן גז כרומטוגרפיה ואחריו MS – מבוססים היטב, אבל יש רגישות נמוכה, נפרד מספיק צורות מולקולריות שונים של שומנים, שומנים derivitization דורשים מראש לניתוח, או יכול להיות די זמן רב. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של גישה ניסויית שלנו כדי לפתור את המגבלות הטמונות באמצעות סקר סריקה ESI / MS לזיהוי וכימות להשלים את כולו של שומנים בתאי שמרים. השיטה המתוארת אינה דורשת הפרדה chromatographic של תערובות השומנים מורכבים התאושש מתאי השמרים, ובכך מאיץ מאוד את תהליך רכישת הנתונים. שיטה זו מאפשרת זיהוי שומנים וכימות על ריכוזים נמוך כמו גרם / מ"ל ו – יושם בהצלחה להערכת lipidomes בתאי שמרים שלם האברונים מטוהרים שלהם. ליפידים מיצוי מתאי שמרים שלם באמצעות שיטה זו של ניתוח השומנים לוקח שעתיים עד שלוש שעות. זה לוקח רק חמש עד עשר דקות לרוץ כל מדגם של שומנים חילוץ מיובשים על ספקטרומטר Q-TOF המוני מצויד מקור ננו electrospray.
Protocol
חומרים ושיטות שמרים זנים ותנאי גידול זן wild-type BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) היה גדל בינוני YEPD עשיר (1% תמצית שמרים, peptone 2%, גלוקוז 2%). היו תאים בתרבית בשעה 30 ° C עם הסיבוב רועד בסל"ד 200 ב צלוחיות Erlenmeyer על יחס "נפח / ב…
Discussion
שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית מהירה של lipidome את השמרים באמצעות זמינים, חומרים זולים. השיטה מאפשרת זיהוי של מרבית המינים השומנים המצוי בתאי שמרים למעט diacylglycerols, ergosterols ו אסטרים ergosteryl, למרות שומנים אלה ניתן לזהות על ידי החלפת הידרוקסיד עם אמוניום הידרוקסיד ליתיום. השיטה המ…
Acknowledgements
אנו מודים אלן טסייה עבור לייעץ, דיונים חשובים, ותמיכה טכנית. אנו מכירים את מרכז עבור יישומים ביולוגיים של ספקטרומטריית מסה ב אוניברסיטת קונקורדיה עבור שירותי מצטיינים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי CIHR לבין NSERC של קנדה. ויט הוא חוקר חדש CIHR ו קונקורדיה יו"ר אוניברסיטת מחקר Genomics, ביולוגיה של התא והזדקנות.
Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).