Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии
Summary
Мы описываем новый количественный метод lipidomics для выявления многочисленных видов липидов в дрожжах использованием обследований сканирования электрораспылением ионизации масс-спектрометрии (ESI / MS). Этот метод в настоящее время превышает методов идентификации и количественного определения липидного в способности для решения самых разных молекулярных форм липидов, чувствительность и скорость.
Abstract
Липиды являются одним из основных классов биомолекул и играют важную роль мембраны динамика, накопление энергии, и сигнализация<sup> 1-4</sup>. Почкующихся дрожжей<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em>, Генетически и биохимически манипуляции одноклеточных эукариот с аннотированный генома и очень простой lipidome, является ценной моделью для изучения биологических функций различных видов липидов в многоклеточных эукариот<sup> 2,3,5</sup>.<em> С. CEREVISIAE</em> Состоит из 10 основных классов липидов с цепью длиной основном 16 или 18 атомов углерода и либо нулевой, либо одну степень ненасыщенности<sup> 6,7</sup>. Существующие методы идентификации и количественного определения липидного – такие, как высокоэффективной жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии, флуоресцентной микроскопии и газовой хроматографии следует MS – хорошо известны, но имеют низкую чувствительность, недостаточно разделения различных молекулярных форм липидов, требуют предварительного липидного derivitization для анализа, или может быть довольно много времени. Здесь мы приводим подробное описание нашего экспериментального подхода к решению этих внутренних ограничений с помощью обследования сканирования ESI / MS для идентификации и количественного определения все дополнение липидов в клетках дрожжей. Описанный метод не требует хроматографического разделения сложных смесей липидных оправился от дрожжевых клеток, тем самым значительно ускорить процесс сбора данных. Этот метод позволяет идентифицировать липидов и количественная на таких низких концентрациях, как г / мл и была успешно применена для оценки lipidomes целых клеток дрожжей и их очищенной органелл. Липиды извлечения из целых клеток дрожжей для использования этого метода липидного анализ занимает от двух до трех часов. Это займет всего пять-десять минут для запуска каждого образца добываемого и сушат липидов на Q-TOF масс-спектрометр оснащен нано-электрораспылением источник.
Protocol
Discussion
Этот метод позволяет быстрое количественной оценки дрожжей lipidome с помощью легко доступных, недорогих материалов. Метод позволяет идентифицировать большинство из липидных видов, обитающих в дрожжевые клетки, за исключением diacylglycerols, ergosterols и ergosteryl эфиры, хотя эти липиды могут быть иден…
Acknowledgements
Мы благодарны Ален Tessier за ценные советы, обсуждения и техническую поддержку. Мы признаем, центр биологических Применение масс-спектрометрии в Конкордии университета за выдающиеся заслуги. Эта работа была поддержана грантами CIHR и NSERC Канады. VIT является следователь CIHR Новые и Concordia University исследований кафедры геномики, клеточной биологии и старения.
References
- Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
- Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
- Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
- Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
- Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
- Brü, g. g. e. r., Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
- Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
