Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

doi: 10.3791/1513 Published: August 21, 2009

Summary

Мы описываем новый количественный метод lipidomics для выявления многочисленных видов липидов в дрожжах использованием обследований сканирования электрораспылением ионизации масс-спектрометрии (ESI / MS). Этот метод в настоящее время превышает методов идентификации и количественного определения липидного в способности для решения самых разных молекулярных форм липидов, чувствительность и скорость.

Abstract

Липиды являются одним из основных классов биомолекул и играют важную роль мембраны динамика, накопление энергии, и сигнализация

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Материалы и методы

  1. Штаммов дрожжей и условий роста
    Штамма дикого типа BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) был выращен в богатой среде YEPD (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 2% глюкозы). Клетки культивировали при 30 ° С с вращательными встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в колбах Эрленмейера на "колбе объем / средний объем" отношением 5:1.
  2. Хранение дрожжевых клеток для экстракции липидов
    1. 50 мл культуры клеток собирают центрифугированием при 3000 мкг в течение 5 минут.
    2. Промывают два раза с холодной водой.
      1. Ресуспендируют гранул в 25 мл ледяной воды
      2. Гранул клеток в центрифуге при 3000 мкг в течение 5 минут
    3. Ресуспендируют гранул и трансфер в Эппендорф трубки
    4. Гранул путем центрифугирования, 16 000 мкг в течение 2 минут, удалите супернатант и заморозить при -80 ° C до использования. (Мы используем стакан изопропиловый спирт хранится в морозильной камере -80, жидкий азот также может быть использован)
  3. Реагенты
    Biotech класса хлороформа и метанола от Sigma-Aldrich. Свободные жирные кислоты и триглицериды были приобретены у Larodan (Мальме, Швеция). Различные виды фосфолипидов - в том числе фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерина, фосфатидная кислоты и cardiolipins - были получены из Avanti Полярный липидов (Alabaster, Алабама, США). Высокоскоростной стекла пробирок с тефлоновым выстроились шапки из Фишер.

Липидный добычи

Это изменение протокола описывается Блая и ​​Дайера 8. Все манипуляции с извлекаемыми липидов должно быть сделано с помощью стеклянной пипетки или шприцы; пластмасс создаст большие фонового сигнала, если они вступают в контакт с хлороформом. Точные объемы не являются критическими тех пор, пока отношения 1:2:0.8 для хлороформ - метанол - H 2 O на шаге 3 и 2:2:1.8 для хлороформ - метанол - H 2 O в шаге 7 сохраняются.

  1. Ресуспендируют замороженных клеток в 1,6 мл ледяной дистиллированной H 2 O.
  2. Передача 1,6 мл клеточной суспензии к высокоскоростному стеклянные трубки центрифуги.
  3. Добавить 6 мл хлороформа и метанола (1:2) смеси и 0,8 мл стеклянных шариков для клеточной суспензии.
  4. Vortex клеточной суспензии со стеклянными шариками два раза в течение 1 мин.
  5. Добавьте 2 мл хлороформа и аккуратно перемешать.
  6. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре с редкими смешивания.
  7. Добавьте 2 мл дистиллированной H 2 O и аккуратно перемешать.
  8. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре с редкими смешивания.
  9. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  10. Сбор всей жидкой фазы в новой высокоскоростной центрифуге трубки стекла.
  11. Добавить 3,2 мл хлороформа в камеру гранулы из шагу 9.
  12. Vortex два раза в течение 1 мин.
  13. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  14. Добавить супернатант в жидкую фазу, начиная с шага 10.
  15. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  16. Откажитесь от верхней (водный) фазы и передачу ниже (органические) фазы в новой высокоскоростной центрифуге трубки стекла.
  17. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
  18. Передача всей супернатант в стеклянный флакон и сухой атмосфере азота.
  19. Растворите липидной пленки в 500 мкл хлороформа и хранить при температуре -20 ° C.

Анализ липидов методом масс-спектрометрии

Акции смесь липидных стандартов в хлороформе должны быть подготовлены заранее, так как в таблице 1, а также исходный раствор метанола - хлороформ (1:1) с 0,1% (об. / об) гидроксида аммония.

  1. До инъекции, объединить 10 мкл образца 10 мкл стандартной смеси липидов представлены в таблице 1. В 200 мкл 1:1, хлороформ: метанол с 0,1% NH 4 OH.
    • Стандарт образца соотношение может быть изменен по мере необходимости.
  2. Решение липидов использованием Micromass Q-TOF масс-спектрометр 2 оснащены нано-электрораспылением источник, работающих на скорости потока 1 мкл / мин.
    • Точные параметры инструмента будет варьироваться от инструмента к инструменту. См. Таблицу 2 для параметров Micromass Q-ToF 2 (Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США), оснащенных нано-электрораспылением источник. Хотя мы и воспользовались высоким разрешением Q-TOF тип масс-спектрометра, это не обязательное требование.
  3. После приобретения масс-спектрах сглаживаются, фон вычитается и по центру, а затем пик список экспортируется в Excel. Пиков каждого липидного класса, то нормализованные к их внутренним стандартам. В зависимости от приложения, оно может быть необходимо делать выполнения дальнейшей пост-обработки, такие как deisotoping и деконволюции.

Таблица 1. Внутренние стандарты липидов, их концентрация встандартные смеси, а режим MS для их анализа.

Липидный класса Стандартный состав цепи Масса стандартной Концентрация (мкг / мл) MS режиме
Фосфатидных кислоты 14:0 / 14:0 591,40 100 Отрицательный
Фосфатидилэтаноламина 14:0 / 14:0 634,45 200 Отрицательный
Фосфатидилинозитол N / A N / A N / A Отрицательный
Фосфатидилсерин 14:0 / 14:0 622,37 40 Отрицательный
Кардиолипин 4x14: 0 619,92 100 Отрицательный
Свободные жирные кислоты 19:00 297,28 100 Отрицательный
Фосфатидилхолин 14:0 / 14:0 650,48 100 Положительный
Триглицериды 13:0 / 13:0 / 13:0 698,63 200 Положительный

Таблица 2. Инструмент настройки для Micromass Q-ToF 2 (Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США), оснащенных нано-электрораспылением источник.

Расход Конус напряжения Капиллярная напряжения Столкновение газа
Положительные режиме 1μl/min -28 V 3,0 кВ 10
Отрицательные режиме 1μl/min 30 В -3,2 КВ 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот метод позволяет быстрое количественной оценки дрожжей lipidome с помощью легко доступных, недорогих материалов. Метод позволяет идентифицировать большинство из липидных видов, обитающих в дрожжевые клетки, за исключением diacylglycerols, ergosterols и ergosteryl эфиры, хотя эти липиды могут быть идентифицированы по замене гидроксида аммония с гидроксидом лития. Описанный метод позволяет идентифицировать липидов и количественная на таких низких концентрациях, как мкг / мл, с концентрацией линейности распространяется свыше 2 до 3 порядков (в зависимости от липидного видов). Хотя соответствующие стандарты для фосфатидилинозитол не в продаже, различных молекулярных форм этого фосфолипида можно оценить, используя стандарты для других видов фосфолипидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарны Ален Tessier за ценные советы, обсуждения и техническую поддержку. Мы признаем, центр биологических Применение масс-спектрометрии в Конкордии университета за выдающиеся заслуги. Эта работа была поддержана грантами CIHR и NSERC Канады. VIT является следователь CIHR Новые и Concordia University исследований кафедры геномики, клеточной биологии и старения.

References

  1. Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
  2. Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
  3. Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
  4. Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
  5. Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
  6. Brü, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
  7. Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
  8. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).More

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter