Summary

En kvantitativ bedömning av jästen Lipidome med elektrospray Spektrometri jonisation

Published: August 21, 2009
doi:

Summary

Vi beskriver en ny kvantitativ lipidomics metod för att identifiera många lipid arter i jäst med hjälp av enkät-scan elektrospray spektrometri jonisation (ESI / MS). Denna metod överstiger tillgängliga metoder för lipid identifiering och kvantifiering av förmågan att lösa olika molekylära former av lipider, känslighet och snabbhet.

Abstract

Lipider är en av de större grupper av biomolekyler och spelar viktiga roller membran dynamik, energilagring, och signalering<sup> 1-4</sup>. Den spirande jäst<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Är en genetiskt och biokemiskt bökbart encelliga eukaryota med kommenterade genomet och mycket enkla lipidome, en värdefull modell för att studera biologiska funktioner för olika lipid arter i flercelliga eukaryoter<sup> 2,3,5</sup>.<em> S. cerevisiae</em> Har 10 stora klasser av lipider med kedjelängd huvudsakligen av 16 eller 18 kolatomer och antingen noll eller en hur omättade<sup> 6,7</sup>. Befintliga metoder för lipid identifiering och kvantifiering – såsom högpresterande vätskekromatografi, tunnskiktskromatografi, fluorescensmikroskopi och gaskromatografi följt av MS – är väl etablerade, men har låg känslighet, otillräckligt separat olika molekylära former av lipider, kräver lipid derivitization före analys, kan eller vara ganska tidskrävande. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av våra experimentell metod för att lösa dessa inneboende begränsningar med hjälp av enkät-scan ESI / MS för identifiering och kvantifiering av hela komplement av lipider i jästceller. Den beskrivna metoden kräver inte kromatografisk separation av komplexa lipider blandningar återhämtat sig från jästceller, vilket avsevärt påskynda processen för datainsamling. Denna metod gör lipid identifiering och kvantifiering vid så låga koncentrationer som g / ml och har med framgång tillämpats för att bedöma lipidomes av hela jästceller och deras renade organeller. Lipider extraktion från hela jästceller för att använda denna metod för lipid-analys tar två till tre timmar. Det tar bara fem till tio minuter att köra varje prov av extraherade och torkade lipider på en Q-TOF-masspektrometer försedd med en nano-elektrospray källa.

Protocol

Material och metoder Jäststammar och villkor tillväxt Den vildtyp stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) odlades i rika YEPD medelhög (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos). Cellerna odlades vid 30 ° C med roterande skaka vid 200 rpm i E-kolvar på en "kolv volym / medelhög volym" förhållandet 5:1. Lagring av jästceller för extraktionen av fettet En 50 ml kultur av celler har skördats genom centrifugering vid 3000 xgi 5 minuter. <…

Discussion

Denna metod möjliggör en snabb kvantitativ bedömning av jästen lipidome med lättillgängliga, billiga material. Metoden gör det möjligt att identifiera de flesta av lipid arter som finns i jästceller, med undantag av diglycerider, ergosterols och ergosteryl estrar, även om dessa lipider kan identifieras genom att ersätta ammoniumhydroxid med litiumhydroxid. Den beskrivna metoden kan lipid identifiering och kvantifiering vid så låga koncentrationer som mikrogram / ml, med koncentrationen linjäritet sprids un…

Acknowledgements

Vi är tacksamma för Alain Tessier för värdefulla råd, diskussioner och teknisk support. Vi erkänner Centrum för biologiska tillämpningar av masspektrometri vid Concordia University för framstående tjänster. Detta arbete har finansierats med bidrag från CIHR och NSERC av Kanada. VIT är en CIHR ny undersökare och Concordia University forskning ordförande i genomik, cellbiologi och åldrande.

References

  1. Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell. 134, 933-944 (2008).
  2. Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane. J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).
  3. Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane. J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).
  4. Russell, S. J., Kahn, C. R. Endocrine regulation of ageing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).
  5. Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).
  6. Br&uuml, g. g. e. r., Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).
  7. Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane. J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).
  8. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).

Play Video

Cite This Article
Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).

View Video