En kvantitativ bedömning av jästen Lipidome med elektrospray Spektrometri jonisation

Summary

Vi beskriver en ny kvantitativ lipidomics metod för att identifiera många lipid arter i jäst med hjälp av enkät-scan elektrospray spektrometri jonisation (ESI / MS). Denna metod överstiger tillgängliga metoder för lipid identifiering och kvantifiering av förmågan att lösa olika molekylära former av lipider, känslighet och snabbhet.

Abstract

Lipider är en av de större grupper av biomolekyler och spelar viktiga roller membran dynamik, energilagring, och signalering^1-4. Den spirande jäst<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Är en genetiskt och biokemiskt bökbart encelliga eukaryota med kommenterade genomet och mycket enkla lipidome, en värdefull modell för att studera biologiska funktioner för olika lipid arter i flercelliga eukaryoter^2,3,5.<em> S. cerevisiae</em> Har 10 stora klasser av lipider med kedjelängd huvudsakligen av 16 eller 18 kolatomer och antingen noll eller en hur omättade^6,7. Befintliga metoder för lipid identifiering och kvantifiering – såsom högpresterande vätskekromatografi, tunnskiktskromatografi, fluorescensmikroskopi och gaskromatografi följt av MS – är väl etablerade, men har låg känslighet, otillräckligt separat olika molekylära former av lipider, kräver lipid derivitization före analys, kan eller vara ganska tidskrävande. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av våra experimentell metod för att lösa dessa inneboende begränsningar med hjälp av enkät-scan ESI / MS för identifiering och kvantifiering av hela komplement av lipider i jästceller. Den beskrivna metoden kräver inte kromatografisk separation av komplexa lipider blandningar återhämtat sig från jästceller, vilket avsevärt påskynda processen för datainsamling. Denna metod gör lipid identifiering och kvantifiering vid så låga koncentrationer som g / ml och har med framgång tillämpats för att bedöma lipidomes av hela jästceller och deras renade organeller. Lipider extraktion från hela jästceller för att använda denna metod för lipid-analys tar två till tre timmar. Det tar bara fem till tio minuter att köra varje prov av extraherade och torkade lipider på en Q-TOF-masspektrometer försedd med en nano-elektrospray källa.

Protocol

Material och metoder Jäststammar och villkor tillväxt Den vildtyp stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) odlades i rika YEPD medelhög (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos). Cellerna odlades vid 30 ° C med roterande skaka vid 200 rpm i E-kolvar på en "kolv volym / medelhög volym" förhållandet 5:1. Lagring av jästceller för extraktionen av fettet En 50 ml kultur av celler har skördats genom centrifugering vid 3000 xgi 5 minuter. <…

Discussion

Denna metod möjliggör en snabb kvantitativ bedömning av jästen lipidome med lättillgängliga, billiga material. Metoden gör det möjligt att identifiera de flesta av lipid arter som finns i jästceller, med undantag av diglycerider, ergosterols och ergosteryl estrar, även om dessa lipider kan identifieras genom att ersätta ammoniumhydroxid med litiumhydroxid. Den beskrivna metoden kan lipid identifiering och kvantifiering vid så låga koncentrationer som mikrogram / ml, med koncentrationen linjäritet sprids un…