Summary
تم تصميم مجموعة أدوات الكشف عن البروتياز نيون لقياس نشاط الأنزيم البروتيني باستخدام قياس التألق. بل هو أيضا مناسبة للكشف عن كميات ضئيلة من التلوث البروتيني. يستند هذا الأسلوب على hydroysis بروتين من صيغة الملكية للركيزة الكازين FITC المسمى.
Abstract
مجموعة أدوات الكشف عن البروتياز نيون يوفر الجاهزة للاستخدام الكواشف للكشف عن وجود نشاط الأنزيم البروتيني. يستخدم هذا الاختبار المسمى الكازين بسيطة للكشف عن نشاط الأنزيم البروتيني مع ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) باعتباره الركيزة.
نتائج النشاط البروتيني في الشق الركيزة الكازين FITC المسمى إلى أجزاء أصغر ، والذي لا يعجل في ظل الظروف الحمضية. بعد مرور فترة الحضانة من العينة البروتيني والركيزة ، ويحمض التفاعل مع إضافة حمض التريكلوروسيتيك حمض (TCA). ثم يتم طرد المخلوط مع الركيزة عسر الهضم تشكيل بيليه وأصغر ذوبان حمض الشظايا المتبقية في الحل. هو تحييد وطاف يقاس مضان من الشظايا FITC المسمى.
ووصف الإجراء عدة بالكشف عن السيطرة البروتيني التربسين بتركيز حوالي 0.5 ميكروغرام / لتر (5 نانوغرام من التربسين إضافة إلى مقايسة). ويمكن زيادة هذه الحساسية مع وقتا أطول الحضانة ، تصل إلى 24 ساعة. يتم إجراء الفحص في أنابيب microcentrifuge وتوفير إجراءات للكشف عن مضان باستخدام إما cuvettes أو لوحات multiwell.
Protocol
إعداد التعليمات
يتم توفير الاحتياطي الحضانة ، مخزن الفحص ، و 0.6 الحل TCA N والجاهزة للاستخدام الحلول.
الركيزة FITC - الكازين -- ينصح قسامة الركيزة FITC - الكازين إلى أصغر وحدات التخزين لدى وصوله لتجنب تكرار تجميد أذاب دورات. إذا تعرض الركيزة FITC - الكازين الى دورات تجميد أذاب المتكررة ، وزيادة طفيفة في الخلفية يحدث ، وبالتالي ، خفض الحساسية. ينبغي تخزين aliquots في -20 درجة مئوية ، ومحمية من الضوء. كل عينة ، رد فعل فارغا ، أو السيطرة يتطلب 20 ميكرولتر من الركيزة FITC - الكازين. تجميد / الذوبان ، وكذلك الاختلاط أو المصافحة قوية يمكن أن يسبب FITC لفصل من الكازين مما أدى إلى ارتفاع خلفية القراءة وتسبب أقل الركيزة لتكون متاحة لتشطر البروتيني.
وثيوسيانات فلوريسئين (FITC) مراقبة الحل ، ويمكن إعادة السيطرة FITC العازلة في الفحص لتركيز مناسبة. وينبغي بذل هذا الحل الطازجة ومحمية من الضوء.
التحكم النهائي التربسين الحل -- أضف 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك ملي 1 إلى القارورة من التربسين ، البروتياز التحكم (رمز المنتج تي 6567). مزيج لفترة وجيزة لضمان حل التربسين. إضافة 900 ميكرولتر من الاحتياطي الحضانة وتخلط جيدا. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مخازن أخرى إذا رغبت في ذلك للمقايسة. تركيز العمل النهائية للالتربسين هو 20 ميكروغرام / ميكرولتر. عندما تصبح جاهزة لإعداد حلول التحكم التربسين ، الجمع بين قسامة من الحل التربسين الحمضية مع المبلغ الصحيح من الاحتياطي الحضانة (1 التربسين يحمض جزئيا إلى قطع عازلة 9). التربسين تخزين تحت ظروف حمضية يزيد من استقرار التربسين. الحل تحكم التربسين حساس درجة الحرارة وغير مستقر في تركيزات منخفضة.
يرجى مراجعة نشرة عدة الفني للتخزين والاستقرار لهذه الحلول التي يجري اعدادها.
إجراء
- فمن الأسهل لإعداد الضوابط ، والفراغات ، وجميع العينات في وقت واحد. لكل عينة اختبار ، وإضافة 20 ميكرولتر من الاحتياطي الحضانة ، 20 ميكرولتر من FITC - الكازين الركيزة ، و 10 ميكرولتر من عينة الاختبار لأنبوب microcentrifuge. لعينات الاختبار مع ارتفاع نشاط الأنزيم البروتيني ، قد يكون مطلوبا تخفيف العينة.
- تحضير عينات الرقابة المناسبة (انظر عينات التحكم) وذلك بإضافة 20 ميكرولتر من الاحتياطي الحضانة ، 20 ميكرولتر من FITC - الكازين الركيزة ، و 10 ميكرولتر من العينة التحكم إلى أنبوب microcentrifuge.
- إعداد نموذج فارغ بإضافة 20 ميكرولتر من الاحتياطي الحضانة ، 20 ميكرولتر من FITC - الكازين الركيزة ، و 10 ميكرولتر من الماء عالى النقاء لأنبوب microcentrifuge.
- المزيج بلطف واحتضان كل أنبوب عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 60 دقيقة. يجب الحرص على عدم خلط بقوة أيضا ، كما قد يسبب الاضطراب المفرط مضان الخلفية ، والحد من حساسية مقايسة.
ملاحظة : يمكن تمديد فترة الحضانة تصل إلى 24 ساعة لزيادة الحساسية. كن حذرا لا تتجاوز 24 ساعة كما الكازين FITC ، قد تبدأ في التدهور ، مما أدى إلى ارتفاع الخلفية مضان. - بعد الاحتضان إضافة 150 ميكرولتر من محلول حمض حمض التريكلوروسيتيك N 0.6 على كل أنبوب microcentrifuge. TCA هو تآكل جدا ويجب التعامل معها في حين يرتدي المعدات المناسبة للحماية.
- المزيج بلطف واحتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة.
- أنابيب الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في ز س 10000 وطاف يحتوي على حامض ، FITC ذوبان شظايا المسمى ، ويستخدم لقياس مضان.
قياسات مضان
يمكن تحجيم هذه الأساليب لأعلى أو إلى أسفل وفقا لمتطلبات الأجهزة المتوفرة. للمقارنة على مستوى منحنى أعدت مع عينات الرقابة المناسبة ، طرح القراءة مضان من عينة فارغة (FLUblank) من قيمة كل عينة اختبار (FLUtest).
Cuvettes
- 10 ميكرولتر ماصة للطاف (الخطوة 7) و 1 مل من الاحتياطي الفحص في مناسبة وكفيت المزيج بلطف. ملاحظة : يمكن تخزين حل مؤقت طاف والفحص في الظلام عند درجة 2-8 لتصل إلى 24 ساعة قبل قياس مضان.
- سجل كثافة مضان مع الإثارة عند 485 نانومتر ، ومراقبة الانبعاثات الطول الموجي من 535 نانومتر.
لوحات Multiwell
- ويمكن تخزين حل مؤقت طاف والفحص في الظلام في 08/02 درجة مئوية لمدة تصل : 10 ميكرولتر ماصة للملاحظة طاف (الخطوة 7) و 1 مل من الاحتياطي الفحص في أنبوب أو قنينة مناسبة ومزيج بلطف قبل 24 ساعة قياس مضان.
- نقل 200 ميكروليتر إلى البئر من 96 لوحة سوداء أيضا. سجل كثافة مضان مع الإثارة عند 485 نانومتر ، ومراقبة الانبعاثات الطول الموجي من 535 نانومتر.
أو
- ماصة 2 ميكرولتر من طاف (الخطوة 7) و 200 ميكرولتر من الفحص Buffer في بئر من 96 لوحة سوداء أيضا. ملاحظة : يمكن تخزين حل مؤقت طاف والفحص في الظلام عند درجة 2-8 لتصل إلى 24 ساعة قبل قياس مضان.
- سجل كثافة مضان مع الإثارة عند 485 نانومتر ، ومراقبة الانبعاثات الطول الموجي من 535 نانومتر.
مراقبة عينات
يمكن استخدام محلول التحكم التربسين لتأكيد الفحص يجري بشكل صحيح ، لتحديد حد الاكتشاف ، أو إنشاء منحنى العامة القياسية. لمقايسة للبروتياز مختلفة محددة ، فمن المستحسن أن يعد حل التحكم التي تحتوي على الأنزيم البروتيني محددة في المنطقة العازلة الحضانة المناسبة.
الحد من الكشف عن مقايسة هي كمية الأنزيم البروتيني الذي ينتج القراءة هامة مضان فوق القيمة التي تم الحصول عليها مع نموذج فارغ. والحد من الكشف تختلف تبعا لحساسية هذه الأجهزة. ويمكن استخدام التخفيفات التسلسلي للحلول التحكم التربسين لتوليد حلول التحكم.
وتعتبر المساواة القراءة إلى 120 ٪ من القيمة التي تم الحصول عليها مع نموذج فارغ كبيرة. بشكل روتيني ، وحصل على الحد من الكشف عن 5 نانوغرام من التربسين مع هذا الإجراء. فمن المستحسن أن يتم تشغيل واحد على الأقل السيطرة التربسين 5 نانوغرام مع كل تجربة. ومن شأن حل السيطرة التربسين بتركيز من 0.5 ميكروغرام / لتر ينتج 5 نانوغرام المرجوة من التربسين في مقايسة. والتخفيف من 40 ضعفا من الحل التحكم التربسين (20 ميكروغرام / مل) النتائج في محلول 0.5 السيطرة ميكروغرام / لتر ، أي جزء واحد من حلول التحكم التربسين إلى 39 أجزاء من الاحتياطي الحضانة.
الشكل 1 (المنحنى القياسي النشاط التربسين) : ويمكن أيضا أن الحل التحكم التربسين (20 ميكروغرام / مل) يمكن استخدامها لتوليد منحنى القياسية من خلال جعل التخفيفات التسلسلي (انظر الشكل 1). تم تصحيح القراءة مضان من كل عينة التحكم عن طريق طرح قراءة مضان من عينة فارغة (FLUblank) من قيمة كل عينة السيطرة (FLUcontrol).
منحنى معيار نموذجي لالتربسين (رمز المنتج تي 6567) باستخدام عينات من هذه المجموعة وتراوحت ما بين 0.15 ميكروغرام / لتر (1.5 نانوغرام) إلى 2.5 ميكروغرام / لتر (25 نانوغرام). تم إنشاء هذا المنحنى من خلال اتباع إجراءات وصفها ، مع فترة حضانة لمدة 30 دقيقة عن الخطوة 4. أجريت قياسات مضان في صفيحة multiwell.
وتقدم فلوريسئين ثيوسيانات كعنصر تحكم لمعايرة أداة ممكنة (انظر تعليمات الشركة المصنعة المناسبة) أو تحديد نطاق الخطي للإشارة FITC.
Discussion
لقد أظهرنا مجرد فحص سبيل المثال باستخدام أدوات الكشف عن البروتياز نيون للكشف عن نشاط الأنزيم البروتيني في عينة بيولوجية. وقد تم تحسين هذه المجموعة للكشف عن مجموعة متنوعة من التطبيقات الموجودة في البروتياز الفسيولوجية. انها مناسبة للكشف عن السيستين ، سيرين ، فلزية ، والبروتياز الأسبارتيك ، ولكن قد تكون هناك حاجة للكشف عن بعض التعديلات البروتياز محددة.
Disclosures
صاحب البلاغ هو موظف من الدريتش سيغما التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Fluorescent Detection Kit | Sigma-Aldrich | PF0100 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H1758 |
References
- Twining, S. S. Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes. Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).
