Biology

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

Published: August 4, 2009 doi: 10.3791/1514

Summary

Proteaz Floresan Algılama Kit Florimetri kullanarak proteaz aktivitesi ölçümü için tasarlanmıştır. Ayrıca eser miktarda proteaz kontaminasyon tespiti için uygundur. Yöntem FITC etiketli kazein substrat özel bir formülasyon proteolitik hydroysis dayanmaktadır.

Abstract

Proteaz Floresan Algılama Seti sağlamaktadır hazır proteaz aktivitesi varlığını tespit için kullanımı reaktifler. Bu basit bir tahlil proteaz aktivitesi tespit etmek için kazeinin, substrat olarak floresein izotiyosiyanat (FITC) ile etiketlenmiş kullanır.

Proteaz aktivitesi asidik koşullar altında çökelek değil küçük parçaları, içine FITC etiketli kazein substrat bölünme ile sonuçlanır. Proteaz örnek ve yüzey inkübasyondan sonra, reaksiyon trikloroasetik asit (TCA) eklenmesi ile asitlendirilmiş. Bu karışım daha sonra bir pelet ve çözelti içinde kalan küçük, asit çözünür parçaları oluşturan sindirilmemiş substratı ile santrifüj edilir. Süpernatant nötralize edilir ve FITC etiketli parçaları floresan ölçülür.

Açıklanan kiti prosedür yaklaşık 0.5 mg / ml (tripsin 5 ng tahlil eklenen) bir konsantrasyon tripsin proteaz kontrol algılar. Bu duyarlılık, daha uzun bir kuluçka süresi, 24 saate kadar artırılabilir. Mikrosantrifüj tüpler tahlil yapılır ve prosedürleri Küvet veya multiwell plakaları kullanarak floresan tespiti için verilmektedir.

Protocol

Hazırlık Talimatı

Kuluçka Tampon, Assay Tampon ve 0.6 N TCA Çözüm kullanıma hazır çözümler olarak sağlanmaktadır.

FITC Kazein Yüzey tekrarlanan donma-çözülme döngüleri önlemek için vardıklarında küçük birimlere kısım FITC Kazein Yüzey tavsiye edilir. FITC Kazein Yüzey tekrarlanan donma-çözülme döngüsüne maruz kalırsa, arka planda hafif bir artış hassasiyet düşürücü, böylece meydana gelecektir. Alikotları, -20 ° C'de saklanan ve ışıktan korunmalıdır. Her bir örnek, boş, ya da kontrol reaksiyon FITC Kazein Yüzey 20 ul gerektirir. Freeze / Çözülme yanı sıra kuvvetli karıştırma veya sallayarak FITC, okuma ve daha az substrat proteaz bölünme için kullanılabilir hale gelmesine neden yüksek bir arka plan ile sonuçlanan Kazein ayrı neden olabilir.

Floresein izotiyosiyanat (FITC) Kontrol Çözüm Testi Tampon FITC kontrolü, uygun konsantrasyonda sulandırılmış olabilir. Bu çözüm, taze ve ışıktan korunmalıdır.

Final tripsin Kontrol Çözümü - 1 mM HCl 100 ul tripsin, Proteaz Kontrolü (Ürün Kodu T 6567) flakon. Tripsin çözülmüş olduğundan emin olmak için kısa bir süre karıştırın. Kuluçka Tampon 900 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Alternatif olarak, eğer tahlil için istenen diğer tamponlar kullanılabilir. Tripsin son çalışma konsantrasyonu 20 mcg / ml. Tripsin Kontrol Çözüm hazırlamak için hazır olduğunuzda, bir kısım Kuluçka Buffer (9 parça tampon 1 yarı asitlendirilmiş tripsin) doğru miktarda asidik tripsin çözüm birleştirir. Tripsin asidik koşullar altında saklanması tripsin istikrarı artırır. Tripsin kontrol çözümü ısıya duyarlı ve düşük konsantrasyonlarda sabit değildir.
Hazırlanan bu çözümler depolama ve istikrarı için kit teknik bülten gözden geçirin.

Prosedür

Bir kerede tüm kontrolleri, boşlukları ve numuneleri hazırlamak için en kolayıdır. Her bir test örneği için, bir mikrosantrifüj tüp 20 ul Kuluçka Buffer, 20 ul FITC Kazein Yüzey ve test örneği 10 ul ekleyin. Yüksek proteaz aktivitesi test örnekleri, örnek seyreltme gerekebilir.
Bir mikrosantrifüj tüp 20 Kuluçka Tampon, 20 ul FITC Kazein Yüzey ve kontrol örneği 10 ul ul ekleyerek uygun kontrol örneklerinde (Kontrol Örnekler) hazırlayın.
Bir mikrosantrifüj tüp 20 Kuluçka Tampon, 20 ul FITC Kazein Yüzey ve ultra saf su 10 ul ul ekleyerek boş bir örnek hazırlayın.
Her bir tüp ve inkübe 37 ° C'de 60 dakika süreyle karanlıkta yavaşça karıştırınız. Türbülansı yüksek floresan arka plan neden olabilir, çok güçlü bir şekilde karıştırın ve testin duyarlılığını azaltmak için dikkatli olun.
Not: İnkübasyon süresi duyarlılığını artırmak için 24 saate kadar uzatılabilir. Yüksek floresan arka önde gelen, 24 saat FITC-Kazein düşmeye başlayabilir aşmayacak şekilde dikkatli olun.
Inkübasyondan sonra her mikrosantrifüj tüpe 0,6 N Trikloroasetik Asit Çözeltisi 150 ul ekleyin. TCA çok aşındırıcı ve uygun koruyucu ekipman giyerek ele alınmalıdır.
37 ° hafifçe karıştırın ve inkübe ° C de 30 dakika süreyle karanlıkta.
10.000 x g. az 10 dakika süreyle tüpleri Santrifüj Süpernatant asit çözünür, FITC etiketli parçaları içeren ve floresan ölçümü için kullanılır.

Floresan Ölçümler

Bu yöntemler ölçekli veya aşağı enstrümantasyon mevcut şartlara göre olabilir. Uygun kontrol örnekleri ile hazırlanan standart eğri karşılaştırma için, her bir test örneği değeri (FLUtest) boş bir örneği (FLUblank) floresan okuma çıkarın.

Hendekler

Pipet 10 süpernatant (adım 7) ve uygun bir küvet içine Testi Tampon 1 ml ul ve hafifçe karıştırın. Not: süpernatant ve Analiz Tampon çözüm floresan ölçüm önce 24 saate kadar 2-8 ° C'de karanlıkta saklanabilir.
485 nm eksitasyon ile floresan kaydetme ve izleme emisyon dalga boyu 535 nm.

Multiwell Tabaklar

Pipet 10 ul supernatant (adım 7) ve uygun bir tüp veya şişenin içine Testi Tampon 1 ml ve hafifçe karıştırın Not: süpernatant ve Analiz Tampon çözüm, 2-8 ° C'de karanlıkta saklanabilir floresan ölçüm 24 saat önce için.
Siyah 96 plaka iyi 200 ul aktarın. 485 nm eksitasyon ile floresan kaydetme ve izleme emisyon dalga boyu 535 nm.
Veya

Pipet süpernatantı 2 ul (adım 7) ve Test B 200 ulsiyah 96 plaka bir kuyuya uffer. Not: süpernatant ve Analiz Tampon çözüm floresan ölçüm önce 24 saate kadar 2-8 ° C'de karanlıkta saklanabilir.
485 nm eksitasyon ile floresan kaydetme ve izleme emisyon dalga boyu 535 nm.

Kontrol Örnekleri

Tripsin Kontrol Çözüm tahlil saptama sınırı belirlemek, ya da genel bir standart eğri oluşturmak için, düzgün gerçekleştirirken onaylamak için kullanılabilir. Farklı, özel bir proteaz testi için, uygun inkübasyon tamponunda proteaz içeren bir kontrol solüsyonu hazırlamak için tavsiye edilir.

Testin algılama limiti, boş bir örneği ile elde edilen değerin üzerinde önemli bir floresan okuma üretir proteaz miktarı. Algılama sınırı enstrümantasyon hassasiyetine bağlı olarak değişir. Tripsin Kontrol Çözüm Seri dilüsyonları kontrol çözümleri oluşturmak için kullanılan olabilir.

Boş bir örneği ile elde edilen değerin% 120 okuma eşit olarak anlamlı kabul edildi. Rutin, tripsin 5 ng algılama sınırı Bu işlem ile elde edildi. Her deney en az bir 5 ng tripsin kontrolü ile çalıştırmak olması tavsiye edilir. 0.5 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile tripsin kontrol çözümü tayininde tripsin istenen 5 ng neden olacaktır. Tripsin Kontrol Çözümü (20 mg / ml) 0.5 mg / ml kontrol çözümü, yani bir parçası Kuluçka Tampon 39 parça tripsin Kontrol Çözüm sonuçları 40 kat seyreltme.

Şekil 1 (tripsin Faaliyet Standart Eğrisi): tripsin Kontrol Çözümü (20 mg / ml) (bkz. Şekil 1) seri dilüsyonları yaparak standart bir eğri oluşturmak için kullanılır. Her bir kontrol örneği floresan okuma boş örnek floresan okuma (FLUblank) her kontrol örneği (FLUcontrol) değeri çıkarılarak giderilmiştir.

0.15 mcg / ml (1.5 ng) 2.5 mg / ml (25 ng) arasında değişen bu seti ve kontrol örnekleri kullanarak tripsin (Ürün Kodu T 6567) için tipik bir standart eğri. Bu eğri açıklanan prosedürü izleyerek, adım 4 için 30 dakikalık bir inkübasyon süresi oluşturulmuştur. Multiwell plaka Floresan ölçümleri yapıldı.

Floresein izotiyosiyanat mümkün alet kalibrasyon kontrolü (uygun üreticinin talimatlarına bakınız) veya FITC sinyal doğrusallık aralığı belirlenmesi sağlanır.

Discussion

Biz sadece biyolojik bir örnek proteaz aktivitesi tespit etmek için Proteaz Floresan Algılama Kit kullanarak bir örnek tahlil göstermiştir. Bu kit, çok çeşitli fizyolojik uygulamalarda bulundu proteazlar tespit etmek için optimize edilmiştir. Serin, sistein, metalli ve aspartik proteazlar tespiti için uygundur, ancak yapılan değişiklikler bazı spesifik proteazlar algılamak için gerekli olabilir.