Biology

Gebruik van de Protease Fluorescerende Detection Kit om Protease activiteit te bepalen

Published: August 4, 2009 doi: 10.3791/1514

Summary

De Protease Fluorescent Detection Kit is ontworpen voor de meting van de protease-activiteit met behulp van fluorometrie. Het is ook geschikt voor de detectie van sporen van protease besmetting. De methode is gebaseerd op de proteolytische hydroysis van een eigen formulering van een FITC-gelabelde caseïne substraat.

Abstract

De Protease Fluorescent Detection Kit biedt kant-en-klare reagentia voor het detecteren van de aanwezigheid van de protease-activiteit. Deze eenvoudige test om protease-activiteit te detecteren maakt gebruik van caseïne gelabeld met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) als substraat.

Protease activiteit leidt tot de splitsing van de FITC-gelabelde caseïnesubstraat in kleinere fragmenten, die niet neerslaan onder zure omstandigheden. Na incubatie van de protease monster en substraat, is de reactie aangezuurd met de toevoeging van trichloorazijnzuur (TCA). Het mengsel wordt vervolgens gecentrifugeerd met de onverteerde substraat vormen van een pellet en de kleinere, zuur oplosbare fragmenten blijven in oplossing. De bovenstaande vloeistof wordt geneutraliseerd en de fluorescentie van de FITC-gelabelde fragmenten wordt gemeten.

De beschreven procedure kit detecteert de trypsine protease controle op een concentratie van ongeveer 0,5 ng / ml (5 ng van trypsine toegevoegd aan de test). Deze gevoeligheid kan worden verhoogd met een langere incubatietijd, tot 24 uur. De test wordt uitgevoerd in microcentrifugebuizen en procedures zijn bedoeld voor fluorescentie detectie met behulp van cuvetten of multiwell platen.

Protocol

Voorbereiding Instructies

De Incubatie Buffer, Assay Buffer, en 0,6 N TCA-oplossing worden geleverd als kant-en-klare oplossingen.

De FITC-caseïnesubstraat - Het is aanbevolen om aliquot de FITC-caseïnesubstraat in kleinere volumes bij aankomst op herhaalde vries-dooi cycli te voorkomen. Als de FITC-caseïnesubstraat is onderworpen aan herhaalde vries-dooi cycli, zal een lichte toename in de achtergrond daardoor ontstaan,, het verlagen van de gevoeligheid. De fracties moet worden bewaard bij -20 ° C en beschermd tegen licht. Elk monster, blanco, of controle reactie vereist 20 ul van de FITC-caseïnesubstraat. Vorst / dooi en krachtig mengen of schudden kan de FITC af te scheiden van de Caseïne resulteert in een hogere achtergrond te lezen en het veroorzaken van minder substraat beschikbaar te zijn voor protease decollete.

De fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) Control Solution-De FITC-controle kan worden opgelost in Assay Buffer naar de juiste concentratie. Deze oplossing moet worden vers gemaakt en beschermd tegen licht.

Het eindverslag van de Trypsine Control Solution - Voeg 100 ul van 1 mM HCl aan de flacon van trypsine, Protease Control (Product Code T 6567). Mix kort om ervoor te zorgen de trypsine is opgelost. Voeg 900 ul van de Incubatie Buffer en meng goed. Als alternatief kunnen ook andere buffers gebruikt worden indien gewenst voor de test. De uiteindelijke werking concentratie van de trypsine is 20 ug / ul. Als u klaar bent om de trypsine Control Solution voor te bereiden, combineren een hoeveelheid van de zure trypsine-oplossing met het juiste bedrag van de Incubatie Buffer (een deel verzuurd trypsine tot 9 delen buffer). Het opslaan van de trypsine onder zure omstandigheden verhoogt de stabiliteit van de trypsine. De trypsine controle-oplossing is de temperatuur gevoelig en is niet stabiel bij lage concentraties.
Lees de kit van de technische bulletin voor de opslag en de stabiliteit van deze bereide oplossingen.

Procedure

Het is het makkelijkst om alle controles voor te bereiden, onafgewerkte stukken en monsters in een keer. Voor elk monster, voeg 20 ul van Incubatie Buffer, 20 ul van FITC-caseïnesubstraat, en 10 pi van het monster een microcentrifugebuis. Voor monsters met een hoge protease activiteit, kan monsterverdunning nodig zijn.
Bereid juiste controlemonsters (zie Controle Monsters) door toevoeging van 20 ul van Incubatie Buffer, 20 ul van FITC-caseïnesubstraat, en 10 ul van de te controleren steekproef om een microcentrifugebuis.
Bereid een blanco monster door het toevoegen van 20 pi van Incubatie Buffer, 20 ul van FITC-caseïnesubstraat, en 10 ul van ultrapuur water om een microcentrifugebuis.
Voorzichtig mengen elke buis en incubeer bij 37 ° C in het donker gedurende 60 minuten. Wees voorzichtig niet al te krachtig mixen, zoals overmatige turbulentie kan een hoge fluorescentie achtergrond oorzaak en verminderen de gevoeligheid van de test.
Let op: Incubatie tijd kan worden verlengd tot 24 uur om de gevoeligheid te verhogen. Wees voorzichtig niet tot 24 uur overschrijden als de FITC-Caseïne kan beginnen te degraderen, wat leidt tot hoge fluorescentie achtergrond.
Na incubatie voeg 150 ul van de 0,6 N Trichloorazijnzuuroplossing aan elke microcentrifugebuis. TCA is zeer corrosief en moeten worden behandeld, terwijl het dragen van de juiste beschermende uitrusting.
Voorzichtig mengen en incuberen bij 37 ° C in het donker gedurende 30 minuten.
Centrifugeer de buizen 10 minuten bij 10.000 x g. Het supernatant bevat het zuur oplosbare, FITC gelabeld fragmenten en wordt gebruikt voor de fluorescentie meting.

Fluorescentie metingen

Deze methoden kunnen worden opgeschaald naar boven of beneden volgens de vereisten van de instrumentatie beschikbaar is. Ter vergelijking: een standaard curve bereid met de passende controle-monsters, trek de fluorescentie lezing van de blanco monster (FLUblank) van de waarde van elk monster (FLUtest).

Cuvetten

Pipetteer 10 ul van het supernatant (stap 7) en 1 ml van de Assay Buffer in een geschikt cuvet en meng voorzichtig. Opmerking: De oplossing van het supernatant en assaybuffer kunnen worden opgeslagen in het donker bij 2-8 ° C gedurende maximaal 24 uur voor het meten van de fluorescentie.
Noteer de fluorescentie-intensiteit met excitatie bij 485 nm en het toezicht op de emissie golflengte van 535 nm.

Multiwell Platen

Pipetteer 10 ul van het supernatant (stap 7) en 1 ml van de Assay Buffer in een geschikte buis of flesje en meng voorzichtig Opmerking: De oplossing van het supernatant en assaybuffer kunnen worden opgeslagen in het donker bij 2-8 ° C gedurende tot 24 uur voor het meten van de fluorescentie.
Transfer 200 ul om een goed van een zwarte 96 wells plaat. Noteer de fluorescentie-intensiteit met excitatie bij 485 nm en het toezicht op de emissie golflengte van 535 nm.
Of

Pipetteer 2 pi van het supernatant (stap 7) en 200 ul van de test Buffer in een putje van een zwarte 96 wells plaat. Opmerking: De oplossing van het supernatant en assaybuffer kunnen worden opgeslagen in het donker bij 2-8 ° C gedurende maximaal 24 uur voor het meten van de fluorescentie.
Noteer de fluorescentie-intensiteit met excitatie bij 485 nm en het toezicht op de emissie golflengte van 535 nm.

Controlemonsters

De Trypsine Control Solution kan worden gebruikt om te bevestigen de test is goed uitvoeren, om de detectielimiet te bepalen, of een algemene norm curve te creëren. Voor de bepaling van een andere, specifieke protease, is het raadzaam om een controle-oplossing met de specifieke protease in de juiste incubatiebuffer te bereiden.

De detectiegrens van de test is de hoeveelheid protease dat een aanzienlijk fluorescentie te lezen boven de waarde verkregen met de blanco monster produceert. De detectiegrens is afhankelijk van de gevoeligheid van de instrumentatie. Seriële verdunningen van de Trypsine Control Solution kan worden gebruikt om de controle-oplossingen te genereren.

Een reading die gelijk is aan 120% van de waarde verkregen met de blanco monster wordt als significant. Routinematig, was een detectielimiet van 5 ng van trypsine verkregen met deze procedure. Het wordt aanbevolen dat ten minste een 5 ng trypsine controle worden uitgevoerd bij elke test. Een trypsine controle-oplossing met een concentratie van 0,5 ug / ml zou resulteren in de gewenste 5 ng van trypsine in de test. Een 40-voudige verdunning van de Trypsine Control Solution (20 ug / ml) resulteert in een 0,5 ug / ml controle-oplossing, dat wil zeggen een deel van Trypsine Control Solution tot 39 delen van Incubatie Buffer.

Figuur 1 (Standard Curve van Trypsine activiteit): De Trypsine Control Solution (20 ug / ml) kunnen ook worden gebruikt om een standaardcurve te genereren door het maken van seriële verdunningen (zie figuur 1). De fluorescentie lezen van elk controlemonster werd gecorrigeerd door het aftrekken van de fluorescentie lezing van de blanco monster (FLUblank) van de waarde van elk controlemonster (FLUcontrol).

Typische standaardcurve voor trypsine (Product Code T 6567) met behulp van deze kit en controlemonsters, variërend van 0,15 ug / ml (1,5 ng) tot 2,5 ug / ml (25 ng). Deze curve is gegenereerd door het volgen van de beschreven procedure, met een incubatietijd van 30 minuten voor stap 4. Fluorescentie metingen zijn verricht in een multiwell plaat.

Fluoresceïne isothiocyanaat is bedoeld als een controle voor mogelijke kalibratie (zie de juiste instructies van de fabrikant) of de bepaling van de lineariteit bereik van het FITC signaal.

Discussion

We hebben net aangetoond een voorbeeld test het gebruik van de Protease Fluorescent Detection Kit om protease-activiteit op te sporen in een biologisch monster. Deze kit is geoptimaliseerd om een diverse waaier van proteasen gevonden in fysiologische toepassingen te detecteren. Het is geschikt voor het opsporen van serine, cysteïne, metallo, en asparaginezuur proteasen, maar aanpassingen nodig zijn om een aantal specifieke proteasen te detecteren.