Biology

Användning av Protease Fluorescent Detection Kit Avgöra Protease aktivitet

Published: August 4, 2009 doi: 10.3791/1514

Summary

Proteaset fluorescerande Detection Kit är utformat för mätning av proteas aktivitet med hjälp fluorometri. Den är också lämplig för detektering av spårmängder av proteas kontamination. Metoden är baserad på proteolytiska hydroysis av en patenterad formula av en FITC-märkt kasein substrat.

Abstract

Proteaset fluorescerande Detection Kit är redo att använda reagens för att upptäcka förekomst av proteas aktivitet. Denna enkla analys att upptäcka proteas aktivitet använder kasein märkta med fluorescein (FITC) som substrat.

Proteas aktivitet leder till klyvning av FITC-märkt kasein substrat i mindre fragment, som inte fälls under sura förhållanden. Efter inkubation av proteas provet och substrat, är reaktionen försurade med tillägg av triklorättiksyra (TCA). Blandningen centrifugeras sedan med osmält substrat bildar en pellet och mindre sura lösliga fragment kvar i lösningen. Supernatanten neutraliseras och fluorescens av FITC-märkta fragment mäts.

Den beskrivna kit förfarande upptäcker trypsin proteas kontroll vid en koncentration av ca 0,5 mikrogram / ml (5 ng av trypsin till i analysen). Denna känslighet kan ökas med en längre inkubationstid, upp till 24 timmar. Analysen utförs i mikrocentrifugrör och rutiner finns för fluorescens detektion med hjälp av antingen kyvetter eller multispot plattor.

Protocol

Instruktioner för

Inkubationen Buffer, analysbuffert och 0,6 N TCA lösning tillhandahålls som färdiga att använda lösningar.

FITC-Kasein Substrat - Det rekommenderas att alikvot FITC-Kasein Substrat i mindre volymer vid ankomst för att undvika upprepade frys-tö cykler. Om den FITC-Kasein Substrat utsätts för upprepade frys-tö cykler, kommer en liten ökning i bakgrunden sker därmed sänka känsligheten. Den alikvoter bör förvaras vid -20 ° C och skyddas från ljus. Varje prov kräver tomma, eller kontroll reaktion 20 ìl av FITC-Kasein substrat. Frys / tina samt kraftig blandning eller skaka kan orsaka FITC att separera från Kasein resulterar i en högre bakgrundsvärden och orsaka mindre substrat att vara tillgänglig för proteas klyvning.

Fluoresceinisothiocyanat (FITC) kontrollösning-FITC-kontrollen kan beredas i analysbuffert till lämplig koncentration. Denna lösning bör göras fräsch och skyddas från ljus.

Final för Trypsin Kontrollösning - Lägg till 100 l på 1 mm HCl till flaskan med trypsin, Protease Control (Product Code T 6567). Blanda kort för att säkerställa att trypsin är upplöst. Tillsätt 900 ìl av Inkubation Buffer och blanda väl. Alternativt kan andra buffertar användas om så önskas för analysen. Den slutliga arbetar koncentrationen av trypsin är 20 mikrogram / l. När du är redo att förbereda Trypsin Kontrollösning, kombinera en alikvot av den sura trypsin lösningen med rätt mängd av inkubationstiden Buffer (1 del syrad trypsin till 9 delar buffert). Förvaring av trypsin under sura förhållanden ökar stabiliteten i trypsin. Den trypsin kontroll Lösningen är temperaturkänsliga och är inte stabil vid låga koncentrationer.
Läs satsens tekniska bulletin för lagring och stabilitet i dessa förberedda lösningar.

Förfarande

Det är enklast att förbereda kontroller, ämnen, och prov på en gång. För varje prov, tillsätt 20 ìl Incubation Buffer, 20 l av FITC-kasein substrat, och 10 ìl av provet till ett mikrocentrifugrör. För prover med höga proteas aktivitet, kan provspädning krävas.
Förbereda lämpliga kontrollprover (se kontrollprov) genom att tillsätta 20 ìl Incubation Buffer, 20 l av FITC-kasein substrat, och 10 ìl av referensprovet en mikrocentrifugrör.
Förbered ett blankprov genom att lägga till 20 l Incubation Buffer, 20 l av FITC-kasein substrat, och 10 ìl av ultrarent vatten till ett mikrocentrifugrör.
Blanda försiktigt varje rör och inkubera vid 37 ° C i mörker i 60 minuter. Var noga med att inte blanda alltför kraftigt, som överdriven turbulens kan orsaka hög fluorescens bakgrund och minskar känsligheten i analysen.
OBS: Inkubationstiden kan förlängas upp till 24 timmar för att öka känsligheten. Var noga med att inte överstiga 24 timmar som den FITC-Kasein kan börja brytas ned, vilket leder till hög fluorescens bakgrund.
Efter inkubation lägga 150 ìl av 0,6 N triklorättiksyrelösning till varje mikrocentrifugrör. TCA är mycket frätande och bör hanteras samtidigt bära lämplig skyddsutrustning.
Blanda försiktigt och inkubera vid 37 ° C i mörker i 30 minuter.
Centrifugera rören i 10 minuter vid 10000 x g. Supernatanten innehåller syra löslig, FITC märkt fragment och används för fluorescens mätningen.

Fluorescensmätningar

Dessa metoder kan skalas upp eller ner enligt kraven av instrument som finns. För jämförelse med en standardkurva förberedd med lämpliga kontrollprover, subtrahera fluorescens läsning av blankprov (FLUblank) från värdet av varje prov (FLUtest).

Kyvetter

Pipettera 10 ìl av supernatanten (steg 7) och 1 ml analysbuffert i en lämplig kyvett och blanda försiktigt. Anmärkning: Lösningen av supernatanten och analysbuffert kan förvaras i mörker vid 2-8 ° C i upp till 24 timmar innan mätning av fluorescens.
Spela in fluorescensintensiteten med excitation vid 485 nm och övervakning av utsläpp våglängd på 535 nm.

Multispot Plattor

Pipettera 10 ìl av supernatanten (steg 7) och 1 ml analysbuffert i en lämplig slang eller flaska och blanda försiktigt Anmärkning: Lösningen av supernatanten och analysbuffert kan förvaras i mörker vid 2-8 ° C i högst till 24 timmar innan du mäter fluorescensen.
Överför 200 l till en brunn i en svart 96 brunnar. Spela in fluorescensintensiteten med excitation vid 485 nm och övervakning av utsläpp våglängd på 535 nm.
Eller

Pipettera 2 l av supernatanten (steg 7) och 200 ìl av analys Buffer i en brunn på en svart 96 brunnar. Anmärkning: Lösningen av supernatanten och analysbuffert kan förvaras i mörker vid 2-8 ° C i upp till 24 timmar innan mätning av fluorescens.
Spela in fluorescensintensiteten med excitation vid 485 nm och övervakning av utsläpp våglängd på 535 nm.

Kontrollprov

Den Trypsin kontrollösning kan användas för att bekräfta analysen fungerar korrekt, att bestämma detektionsgränsen, eller skapa en allmän standard kurva. För prövning av en annan, specifik proteas, rekommenderas att förbereda en kontroll som innehåller de specifika proteas i rätt inkubation buffert.

Detektionsgränsen för analysen är mängden proteas som producerar en betydande fluorescens läsning över det värde som erhålls med blankprov. Detektionsgränsen varierar beroende på hur känsligt instrument. Seriella spädningar av Trypsin Kontrollösning kan användas för att generera kontrollen lösningar.

En läsning som motsvarar 120% av värdet med blankprov anses vara betydande. Rutinmässigt, var en detektionsgräns på 5 ng av trypsin erhålls med detta förfarande. Det rekommenderas att minst en 5 ng trypsin kontroll köras vid varje analys. En trypsin kontroll lösning med en koncentration av 0,5 mikrogram / ml skulle ge önskad 5 ng av trypsin i analysen. En 40-faldig utspädning av Trypsin kontrollösning (20 mikrogram / ml) resulterar i en 0,5 mikrogram / ml kontroll lösning, dvs en del av Trypsin kontrollösning till 39 delar av Incubation Buffer.

Figur 1
Figur 1 (standardkurva av trypsin aktivitet): Den Trypsin kontrollösning (20 mikrogram / ml) kan också användas för att generera en standardkurva genom att göra spädningar (se figur 1). Fluorescensen läsning av varje kontrollprov har korrigerats genom att subtrahera fluorescens läsning av blankprov (FLUblank) från värdet av varje kontrollprov (FLUcontrol).

Typisk standardkurva för trypsin (Product Code T 6567) med hjälp av detta kit och kontrollprover från 0,15 mikrogram / ml (1,5 ng) till 2,5 mikrogram / ml (25 ng). Denna kurva genererades genom att följa det beskrivna förfarandet, med en inkubationstid på 30 minuter för steg 4. Fluorescens mätningar gjordes i en multispot tallrik.

Fluoresceinisothiocyanat tillhandahålls som en kontroll för eventuella instrumentkalibrering (se lämplig tillverkarens anvisningar) eller bestämning av en linjär utbud av FITC signalen.

Discussion

Vi har just visat ett exempel på analys med hjälp av Protease Fluorescent Detection Kit för att upptäcka proteas aktivitet i ett biologiskt prov. Detta kit har optimerats för att upptäcka en mängd olika proteaser som finns i fysiologiska tillämpningar. Den är lämplig för detektering av serin, cystein, metallorganiska och asparaginsyra proteaser, men kan modifieringar behövas för att upptäcka vissa specifika proteaser.