L'utilisation du kit de détection de protéase fluorescent pour déterminer l'activité de protéase

Summary

Le kit de détection de protéase fluorescent est conçu pour la mesure de l'activité de la protéase à l'aide fluorométrie. Il est également approprié pour la détection de traces de contamination de la protéase. La méthode est basée sur la hydroysis protéolytique d'une formulation exclusive d'un substrat marqué FITC caséine.

Abstract

Le kit de détection de protéase Fluorescent offre de prêt-à-utiliser des réactifs pour détecter la présence d'une activité protéase. Ce test simple pour détecter l'activité de la protéase utilise la caséine marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme substrat.

Résultats de l'activité protéase dans le clivage du substrat de caséine marqué FITC en fragments plus petits, qui ne précipitent pas dans des conditions acides. Après une incubation de l'échantillon de protéase et le substrat, la réaction est acidifié avec l'addition d'acide trichloracétique (TCA). Le mélange est ensuite centrifugé avec le substrat non digérés formant une boulette et la plus petite, de l'acide fragments solubles restant en solution. Le surnageant est neutralisé et la fluorescence des fragments marqués au FITC est mesurée.

La procédure décrite kit détecte le contrôle de la protéase trypsine à une concentration d'environ 0,5 pg / ml (5 ng de trypsine ajoutée à l'essai). Cette sensibilité peut être augmentée avec un temps d'incubation plus longue, jusqu'à 24 heures. Le dosage est réalisé dans des microtubes et des procédures sont prévues pour la détection par fluorescence en utilisant soit des cuvettes ou des plaques multipuits.

Protocol

Instructions pour la préparation

Le tampon d'incubation, tampon de dosage, et de 0,6 N TCA Solution sont fournis à titre de prêt-à-utiliser des solutions.

Le Substrat FITC-caséine - Il est recommandé de l'aliquote Substrat FITC-caséine en volumes plus petits à l'arrivée pour éviter la répétition des cycles gel-dégel. Si le substrat FITC-caséine est soumis à répétition cycles gel-dégel, une légère augmentation dans le fond va se produire, ce qui, en abaissant la sensibilité. Les aliquotes doivent être conservés à -20 ° C à l'abri de la lumière. Chaque échantillon, la réaction de vide ou de contrôle nécessite 20 ul du substrat FITC-caséine. Gel / dégel ainsi que le mélange ou en secouant vigoureusement peut provoquer la FITC se séparer de la caséine entraînant une plus grande base de lecture et causant moins de substrat à être disponibles pour le clivage de la protéase.

L'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) Solution de contrôle-Le témoin FITC peut être reconstitué en tampon d'essai à la concentration appropriée. Cette solution devrait être préparée et protégé de la lumière.

Finale de la solution de contrôle de trypsine - Ajouter 100 ul d'HCl 1 mM dans le flacon de la trypsine, la protéase de contrôle (code de produit 6567 t). Mélanger brièvement pour assurer la trypsine est dissoute. Ajouter 900 pi de tampon d'incubation et bien mélanger. Sinon, les autres tampons peuvent être utilisés si désiré pour l'essai. La concentration de travail finale de la trypsine est de 20 pg / pl. Lorsque vous êtes prêt pour préparer la solution de contrôle de trypsine, mélanger une partie aliquote de la solution de trypsine acide avec la quantité correcte du tampon d'incubation (1 trypsine acidifiés partie tampon 9 parties). Stockage de la trypsine dans des conditions acides augmente la stabilité de la trypsine. La solution de contrôle trypsine est sensible à la température et n'est pas stable à faible concentration.
S'il vous plaît examiner le bulletin technique du kit pour le stockage et la stabilité de ces solutions préparées.

Procédure

1. Il est plus facile de préparer les témoins, des blancs et des échantillons en une seule fois. Pour chaque échantillon testé, ajouter 20 ul de tampon d'incubation, 20 ul de FITC-substrat de caséine, et 10 pi de l'échantillon de test dans un tube à centrifuger. Pour les échantillons de test avec une activité élevée de protéase, la dilution de l'échantillon peut être nécessaire.
2. Préparer les échantillons de contrôle appropriés (voir échantillons de contrôle) en ajoutant 20 pl de tampon d'incubation, 20 ul de FITC-substrat de caséine, et 10 pi de l'échantillon de contrôle à un microtube.
3. Préparer un échantillon témoin en ajoutant 20 pl de tampon d'incubation, 20 ul de FITC-substrat de caséine, et 10 pl d'eau ultra-pure dans un tube à centrifuger.
4. Mélanger doucement chaque tube et incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 60 minutes. Soyez prudent de ne pas mélanger trop vigoureusement, que la turbulence excessive peut provoquer une forte fluorescence de fond et de réduire la sensibilité du dosage.
   Remarque: Le temps d'incubation peut être prolongée jusqu'à 24 heures pour augmenter la sensibilité. Attention à ne pas dépasser 24 heures comme le FITC-caséine peut commencer à se dégrader, conduisant à fond de fluorescence élevé.
5. Après incubation, ajouter 150 ul de la solution 0,6 N d'acide trichloracétique à chaque microtube. TCA est très corrosif et doit être manipulé en portant l'équipement de protection approprié.
6. Mélanger délicatement et incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 30 minutes.
7. Centrifuger les tubes pendant 10 minutes à 10000 x g. Le surnageant contient de l'acide soluble, FITC fragments marqués et est utilisé pour la mesure de la fluorescence.

Les mesures de fluorescence

Ces méthodes peuvent être agrandies ou réduites selon les exigences de l'instrumentation disponible. Par comparaison à une courbe standard préparée avec les échantillons de contrôle appropriés, il faut soustraire la lecture de fluorescence de l'échantillon à blanc (FLUblank) de la valeur de chaque échantillon à tester (FLUtest).

Cuves

1. Pipeter 10 ul du surnageant (étape 7) et 1 ml de tampon de dosage dans une cuvette adaptée et mélanger doucement. Remarque: La solution du tampon de dosage surnageant et peuvent être stockés dans l'obscurité à 2-8 ° C pendant jusqu'à 24 heures avant de mesurer la fluorescence.
2. Enregistrement de l'intensité de fluorescence avec excitation à 485 nm de longueur d'onde et le suivi des émissions de 535 nm.

Plaques multipuits

1. Pipeter 10 pl de la note surnageant (étape 7) et 1 ml de tampon de dosage dans un tube approprié ou flacon et mélanger doucement: La solution du tampon de dosage surnageant et peuvent être stockés dans l'obscurité à 2-8 ° C jusqu'à à 24 heures avant de mesurer la fluorescence.
2. Transférer 200 ul d'un puits d'une plaque de 96 puits noire. Enregistrement de l'intensité de fluorescence avec excitation à 485 nm de longueur d'onde et le suivi des émissions de 535 nm.
   Ou

1. Pipeter 2 pl du surnageant (étape 7) et 200 pi de la B AssayUffer dans un puits d'une plaque de 96 puits noire. Remarque: La solution du tampon de dosage surnageant et peuvent être stockés dans l'obscurité à 2-8 ° C pendant jusqu'à 24 heures avant de mesurer la fluorescence.
2. Enregistrement de l'intensité de fluorescence avec excitation à 485 nm de longueur d'onde et le suivi des émissions de 535 nm.

Les échantillons de contrôle

La solution de contrôle de trypsine peut être utilisée pour confirmer le dosage est fonctionne pas correctement, afin de déterminer la limite de détection, ou de créer une courbe de la norme générale. Pour le dosage d'un différent, protéase spécifique, il est recommandé de préparer une solution de contrôle contenant les protéases spécifiques dans le tampon d'incubation appropriée.

La limite de détection du test est le montant de la protéase, qui produit une lecture significative de fluorescence au-dessus de la valeur obtenue avec l'échantillon témoin. La limite de détection varie en fonction de la sensibilité de l'instrumentation. Dilutions en série de la solution de contrôle trypsine peut être utilisée pour générer les solutions de contrôle.

A la lecture égale à 120% de la valeur obtenue avec l'échantillon à blanc est considéré comme significatif. Régulièrement, une limite de détection de 5 ng de trypsine a été obtenue avec cette procédure. Il est recommandé qu'au moins un de 5 ng de trypsine de contrôle seront effectués à chaque dosage. Une solution de contrôle trypsine avec une concentration de 0,5 pg / ml entraînerait la désirée de 5 ng de trypsine dans le dosage. Une dilution de 40 fois la solution de contrôle de trypsine (20 ug / ml), on obtient une solution de contrôle 0,5 pg / ml, soit une partie de la solution de contrôle de trypsine à 39 parties de tampon d'incubation.

La figure 1 (courbe standard de l'activité trypsine): La solution de contrôle de trypsine (20 pg / ml) peut aussi être utilisé pour générer une courbe standard en faisant des dilutions en série (voir figure 1). La lecture de fluorescence de chaque échantillon de contrôle a été corrigé en soustrayant la lecture de la fluorescence de l'échantillon à blanc (FLUblank) de la valeur de chaque échantillon de contrôle (FLUcontrol).

Courbe standard de la trypsine (code de produit T 6567) en utilisant ce kit et des échantillons de contrôle allant de 0,15 pg / ml (1,5 ng) à 2,5 pg / ml (25 ng). Cette courbe a été généré en suivant la procédure décrite, avec un temps d'incubation de 30 minutes pour l'étape 4. Les mesures de fluorescence ont été faites dans une plaque multipuits.

Isothiocyanate de fluorescéine est fourni comme un contrôle d'étalonnage des instruments possibles (voir les instructions du fabricant appropriée) ou la détermination de la gamme de linéarité du signal FITC.

Discussion

Nous venons de montrer un test exemple en utilisant le kit de détection de protéase fluorescent pour détecter l'activité de la protéase dans un échantillon biologique. Ce kit a été optimisé pour détecter un large éventail de protéases dans les applications physiologiques. Il est adapté pour la détection de la sérine, la cystéine, métallo, et des protéases aspartiques, toutefois, des modifications peuvent être nécessaires pour détecter certaines protéases spécifiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Fluorescent Detection Kit	Sigma-Aldrich	PF0100
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758