Summary
分析用超遠心器（AUC）サンプルセルは、サンプルとリファレンスバッファを保持し、実験中に、最大60,000 RPMまで高真空およびローター速度にさらされています。このビデオでは、AUCの実験のこの非常に重要なコンポーネントの組立、荷重と位置合わせのために必要な細部への厳格な注意を紹介します。
Abstract
分析用超遠心器（AUC）は、私たちは高速遠心分離中に高分子の沈降プロファイルを記録することができる強力な生物物理学的なツールです。適切に計画して実行すると、AUCの沈降速度や沈降平衡実験では、サイズと形状に関しての蛋白質、サンプルの純度、沈降係数、オリゴマー化状態とタンパク質間相互作用について多くを明らかにすることができます。
この手法は、しかし、技術的な関心の厳格なレベルを必要とします。サンプルセルは2つのウィンドウのアセンブリの間に挟まれたセクタセンターピースを保持する。これらは、/ポンドで約120から140のトルクの圧力で密封されています。速度で回転しながら光検出システムが、各中核部門を通して、同じラジアルパスの正中線でのサンプルとリファレンスバッファの両方をスキャンするように、リファレンスバッファおよびサンプルは、目玉のセクターにロードされ、その後、シールした後、細胞を正確にチタン製ローターに並んでいる最大60、000 rpmまでと非常に高真空下での
だけでなく、重要な、適切な試料セルのアセンブリは、サンプルの細胞成分は非常に高価であり、されており、彼らが実験中に漏れや破損を避けるために最適な作業状態であることを確認するため、適切に世話をする必要があります。少しでも亀裂や傷が遠心分離機の破損につながることができるため、慎重に窓を扱う。目玉と窓の間の接触はできるだけタイトにする必要があります。トルクの圧力が印加された後、すなわち無ニュートンのリングが見えるはずです。ほこり、糸くず、窓やセンターピースのどちらかの傷や油のすべての妥協この接触と非常に簡単にすべて一緒に1つのセクタから別のソリューションの漏洩または中心から漏れにつながることができます。貴重なサンプルは、実験中のソリューションの漏出、失われる多くの場合、壊れた窓やセンターピースにつながる細胞内の圧力の不均衡の原因となるだけでなく。さらに、プラグのガスケットとハウジングのプラグは、遠心分離室内の高真空での読み込み穴から目玉の部門から引き出されているソリューションを避けるために、所定の位置にしっかり必要があります。ウィンドウのライナーやガスケットは、壊れた窓、結果として運動を引き起こす可能性のある休憩やクラックのない状態でなければなりません。
このビデオでは、コンポーネントの損傷、完璧なAUCの実験中に、ソリューション漏れや破損を最小限にするためにサンプルセルアセンブリ、トルク、負荷及びローターの配置の私たちの手順をデモンストレーションを行います。
Protocol
サンプルセルアセンブリとトルク
- 我々は、2つのウィンドウのアセンブリを一緒に置くことによって、試料セルの建設を開始。
ウィンドウホルダーにウィンドウのガスケットを置きます。ライナーの開口部がホルダーのキー溝の反対側になるようにウィンドウのホルダー内のウィンドウのライナーを（または、それが時々窓のクッションと呼ばれる）に置きます。少し傾けて、ウィンドウのホルダーのキーの方法でウィンドウ上のスクライブマークを合わせてホルダーにウィンドウを配置します。ウィンドウの両側に非常に端に軽く下に押します。 - 適切なシールとサンプルセルの正確なトルクを確保するために、我々軽くコートSpinkote潤滑剤付き住宅のガスケットとねじリング。親指と人差し指の間にSpinkoteの非常に少量を広げる。 Spinkoteの薄い、目に見えない薄膜でコーティングスクリューリングスレッドを。同様に、コートハウジングガスケットを。目に見える潤滑剤を拭き取ってください。
- 住宅のキーでキー溝を合わせてセルのハウジング内に、ウィンドウを手前上に向けて、つのウィンドウのアセンブリをスライドさせて、試料セルのアセンブリを開始します。住宅の鍵で目玉のキー溝を合わせ、静かに細胞内でウィンドウアセンブリの上に落としてください。
- セルのハウジング内に中心をプッシュするためのツールの任意の並べ替えを使用しないでください。これは、実験中にリークが発生CPに永久的な損傷を引き起こす可能性があります。ウィンドウは、あなたから離れて、中心に向かって直面しているように、2番目のウィンドウアッセンブリを回し、住宅の鍵とキー溝を合わせ、センターピースの上にそれを下にスライドさせます。単語"アウト"が表示されるように、その後、上部のネジリングをハウジングのガスケットを置きます。あなたの指とアライメントツールを使用して、手はスクリューリングを締め付けます。
CPは、住宅のバレルに簡単にスライドしない場合は、最初にそれを合わせ、その後、それの上に別のウィンドウのアセンブリを配置します。ウィンドウアセンブリの穏やかな下方圧力を適用することによって、同時にセルのハウジング内に両方をスライドさせます。このように、我々は、CPで直接押すことは避けてください。
今は埃、糸くずや指紋のセルの内部を見るのに良い時期です。また、CPと窓の間に空気が残っていることを示すニュートンリングに気づくでしょう。これらは、トルクを適用した後に消えます。 - ネジのリング上と目に見える"アウト"という言葉で、トルクのスタンドのセルトルクコレット内部試料セルのすべての方法を下にして置かない。トルクのスタンドのハンドルを一定の圧力を適用することによって所定の位置にセルを保持する。つの連続した動きで、ポンドで120から140の間にネジリングを締め付けます。調整可能なマイクロメータのトルクレンチを使用している場合は、/ポンドで120から140の間にそれを設定し、設定トルクに達したことを示すレンチ"クリック"するまで、ねじリングを締め付けます。トルクのスタンドのハンドルを解放し、慎重に窓を触れることなく、試料セルを削除します。
サンプルセルのロードとシーリング
- 沈降速度の実験のために、我々は日常的に200ulのピペットを使用して12ミリメートルセンターピースの各部門に400ulのボリュームをロードする。トップと目に見えるネジのリング上で"アウト"という言葉で読み込む穴に試料セルを配置します。ロードの穴を通して左中心の部門にピペットチップを半押しスライドさせ、徐々に標準溶液の200ulを分注する。 400ulを合計して一回繰り返します。同じピペットチップと同じテクニックを使用して、慎重にゆっくりと試料溶液の400ulとRIGHT目玉分野を埋める。
150から180 ULのボリュームは、沈降平衡実験に使用されますが、同じ注意とテクニックに従ってください。
それは、できる限り緊密にリファレンスとサンプルソリューションのボリュームと一致することが不可欠です。ローディングバブルを回避し、両方のソリューションをできるだけ均等にボリュームを維持するのにすべての援助のために同一のピペットチップを使用して、徐々にソリューションをロードし、調剤、しっかりとピペットにピペットチップの取り付け。 - 彼らはセンターピースとアルミ製のハウジングとの間に配置されていることを確認し、各荷重の穴にぴったりと2つの新しい赤い住宅のプラグのガスケットを配置することにより、セルをシール。住宅のプラグをそれぞれカバー。手には小型のマイナスドライバでネジを締めます。
ローターのサンプルセル配置
- ローターをロードする前に、対抗勢力がそのサンプルセルのリーク場合に対向する位置に試料セルを超えない0.5未満グラム軽量であることを確認してください。ゼロ残高から始めます。最初のCBは逆の位置になるサンプルセルの重量を量る。サンプルセルの重量を減算する天びんは、その後、CBの重量を量る。カウンターバランスの取付穴からの重量を加算または減算。重みは上からはみ出さないよう確認してください。対抗勢力の最終重量は0.5グラム内に反対の試料セルに比べて軽量であることを保証するために重さを量り直す。
- 4場所のローターを使用して、白い矢印が表示されるように位置4にカウンターバランスを置いて、tに指し遠心力の彼の方向。それがダウンしてローター内部のすべての方法であることを確認してください。対抗勢力はまだ整列することができる場所にしっかりとあるが、まで、慎重にちょうど白い矢印の向かいにカウンターバランスの上に見られる一連のネジを、締め。ハウジングとバランスのとれたサンプルセルの位置をローターの中心と目に見えるネジリング上の単語"out"を直面しているプラグ。
- ローターの下から見ると、整列ツールを使用して、カウンター上のスクライブマークと内側のスクライブマークを（ローターの中心に最も近いマーク）に合わせます。場所に並んでカウンターバランスをロックする止めネジを締めます。同じように、ロータ上の位置2に内部のスクライブマークのついた試料セルのスクライブマークを合わせます。
詳細については参照してくださいhttps://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Discussion
ローターの適切なセルアセンブリ、サンプルの挿入、およびセルの配置は、高品質のAUCの実験のための非常に重要です。これは、タンパク質の相互作用を研究し、トレース集計量を決定するなどの高分子の沈降プロファイルの取得したデータを、、の非常に詳細な分析を必要とする実験のために、特に、真です。多くの場合、実験の品質は、AUCの研究の結果の正確さと精度のために制限しています。 3 - 実用的な設計とAUCの実験のさらなる実行の詳細については、参考文献1を参照してください。実用的なセットアップをカバーするワークショップ、理論、およびAUCの実験のデータ解析は、国立衛生研究所の研究室[4] 1年に2回程度開催されている。
Acknowledgments
我々は、NIBIB、NIHの学内研究プログラムで研究支援を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Spinkote Lubricant | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Cell Housing kit | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Window gasket | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Window, sapphire | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Window, quartz | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Window holder | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Cell plug gaskets | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Cell housing plug | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
References
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
