Summary
טכניקה לנתיחה להסרת gyrus משוננת מהעכבר הבוגרת תחת stereomicroscope הודגם פרוטוקול וידאו מוקלט זה.
Abstract
ההיפוקמפוס הוא אחד האזורים הכי למד נרחב במוח בגלל תפקיד פונקציונלי חשוב שלה עיבוד הזיכרון והלמידה, פלסטיות עצבית יוצאת דופן התא שלו, את מעורבותה אפילפסיה, מחלות ניווניות, והפרעות פסיכיאטריות. ההיפוקמפוס הוא מורכב אזורים נפרדים; gyrus משוננת, אשר כוללת בעיקר נוירונים גרגיר, ו קרן של עמון, אשר כוללת בעיקר עצב פירמידליים, ושני אזורים המחוברים על ידי שני מעגלים אנטומיים ותפקודיים. MRNAs רבים ושונים וחלבונים באים לידי ביטוי סלקטיבי gyrus משוננת, ועל gyrus משוננת הוא אתר של neurogenesis מבוגר, כלומר, נוירונים חדשים נוצרים ללא הרף gyrus משוננת מבוגר. כדי לחקור את ה-mRNA וחלבון ביטוי ספציפי gyrus משוננת, microdissection לייזר ללכוד משמש לעתים קרובות. שיטה זו יש מספר מגבלות, לעומת זאת, כגון צורך מיוחד מנגנוני ונהלי הטיפול מסובך. בפרוטוקול וידאו מוקלט זה, אנו להפגין טכניקה לנתיחה להסרת gyrus משוננת מהעכבר הבוגרת תחת stereomicroscope. דגימות gyrus משוננת מוכן באמצעות טכניקה זו מתאימים assay, לרבות transcriptomic, proteomic, ביולוגיה של התא מנתח. אנחנו אישר כי הוא רקמה גזור gyrus משוננת ידי ביצוע בזמן אמת PCR של גנים ספציפיים gyrus משוננת, טריפטופן 2,3-dioxygenase (TDO2) ו desmoplakin (DSP), וכן קרן של עמון גנים מועשר, Meis הקשורות 1b גן (Mrg1b ) ואת החלבון טירוזין קינאז TYRO3 3 (Tyro3). הביטויים mRNA של TDO2 ו DSP בדגימות gyrus משוננת התגלו ברמות גבוהות יותר ברור, בעוד Mrg1b ו Tyro3 היו רמות נמוכות יותר, מאשר אלו בדגימות של קרן עמון. כדי להדגים את היתרון של שיטה זו, ביצענו ניתוח ה-DNA microarray באמצעות דגימות של ההיפוקמפוס שלם gyrus משוננת. הביטוי של mRNA TDO2 ו-DSP, אשר באים לידי ביטוי סלקטיבי gyrus משוננת, בהיפוקמפוס שלם של אלפא CaMKII + / - עכברים, הציג 0.037 ו - 0.10 פי שינויים בהשוואה לזו של wild-type עכברים, בהתאמה. ב gyrus משוננת מבודדים, לעומת זאת, ביטויים אלה הוצגו 0.011 ו 0.021 פי שינויים בהשוואה לזו של wild-type עכברים, הוכחת כי ביטוי גנים שינויים gyrus משוננת ניתן להבחין ברגישות רבה יותר. יחדיו, טכניקה זו לנתיחה נוח ומדויק ניתן להשתמש באופן אמין ללימודי התמקדו gyrus משוננת.
Protocol
Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס
- בשנת עכבר בהרדמה עמוקה, בזהירות לנתח את המוח מן הגולגולת מקום אותו קר כקרח פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
- בצלחת פטרי המכילות קר כקרח PBS, לחתוך את המוח לאורך סדק האורך של המוח הגדול באמצעות סכין כירורגית, ותחתוך את האזורים האחורי כדי למבדה (המוח התיכון, למוח האחורי, לבין המוח הקטן).
- מניחים את הכדור בצד המדיאלי מוחין מעלה, בעזרת מלקחיים, בזהירות להסיר את diencephalon (התלמוס וההיפותלמוס) תחת מיקרוסקופ לנתיחה. זה יחשוף את הצד המדיאלי של ההיפוקמפוס, המאפשרת ויזואליזציה של gyrus משוננת. Gyrus משוננת היא להבדיל בין קרן של עמון ידי הפערים ביניהם. פגיעה בהיפוקמפוס או והסביבה יקשה יותר על מנת לבודד את gyrus משוננת.
- הכנס חדה מחט קצה (לדוגמה, 27-מד מחט) לתוך צד של gyrus משוננת (בגבולות gyrus משוננת ו קרן של עמון; איור 1), והחלק את המחטים שטחית לאורך ציר septo-הזמני של ההיפוקמפוס כדי לבודד gyrus משוננת.
- תרימי את gyrus משוננת מבודדים באמצעות מחט או מלקחיים ומניחים אותו בתוך צינור דגימה. המדגם ובכך, להשיג משוננת רקמות gyrus ניתן להשתמש מיד assay או לאחסן במקפיא עמוק לשימוש מאוחר יותר.
- לבודד את gyrus משוננת מן האונה מוחין אחרים תוך שימוש באותה שיטה.
כמותי בזמן אמת PCR
Gyrus משוננת היה מבודד באמצעות השיטה הנ"ל לבין ההיפוקמפוס שנותר היה גזור בתור מדגם קרן של עמון מפני wild-type עכברים. בזמן אמת PCR של ביתא אקטין, TDO2, DSP, Mrg1b ו Tyro3 בוצעו עם gyrus משוננת דגימות קרן של עמון כפי שתואר לעיל 1. Primers 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG ו 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC שימשו Mrg1b ו GCCTCCAAATTGCCCGTCA ו 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA עבור Tyro3.
ניתוח microarray
הניסויים בוצעו microarray עם wild-type עכברים זכרים ועכברים הטרוזיגוטיים איזופורם אלפא של סידן / calmodulin תלויי חלבון קינאז II (אלפא CaMKII + / - עכברים) כפי שתואר לעיל 1. בקצרה, RNA שבודד בהיפוקמפוס כולו או gyrus משוננת של עכברים wild-type ו מוטנטים היה הכלאה עם מערך עכבר הגנום 2.0 430 (Affymetrix, סנטה קלרה, קליפורניה), וכל GeneChip נסרק על ידי סורק GeneChip Affymetrix 3000 (GCS3000) . ניתוח GeneChip בוצע ניתוח microarray Suite גירסה 5.0.
Discussion
Gyrus משוננת תופסת כ -25% עד 30% מנפח של היווצרות בהיפוקמפוס 2,3. יש לו תא הרכב ייחודי משחק תפקידים מכריעים תפקודי המוח השונים. לכן, שיטות כדי לבודד את gyrus משוננת שימושיים לניתוח האירועים המתרחשים במיוחד באזור זה.
הנה, הראינו הליך ביעילות לנתח את gyrus משוננת מן ההיפוקמפוס עכבר מבוגר ואישר את הדיוק של הטכניקה. ראשית, המחקר גילה כי היסטולוגית gyrus משוננת הופרדה ללא זיהום על ידי אזורים אחרים (איור 1), המציין כי דגימת טהור gyrus משוננת יכול להיות מוכן.
שנית, אנו אישר כי הוא רקמה גזור gyrus משוננת ידי ביצוע בזמן אמת PCR של gyrus ספציפיים גנים משוננת, TDO2 ו-DSP, ואת קרן מועשר של עמון גנים, Mrg1b ו Tyro3 4 (איור 2). MRNA ביטויי TDO2 (p = 0.000023; n של = 4 ו - 4, בהתאמה) DSP (p = 0.0000030; n של = 4 ו - 4, בהתאמה) בדגימות gyrus משוננת התגלו ברמות כמובן גבוה יותר, ואילו Mrg1b (p = 0.000080; של n = 4 ו - 4, בהתאמה) Tyro3 (p = 0.00017; = 4 ו - 4, בהתאמה) של n היו רמות נמוכות יותר, מאשר אלו בדגימות של קרן עמון. Beta-אקטין רמות הביטוי לא היה שונה בדגימות אלה (p = 0.11; = 4 ו - 4, של n בהתאמה). כך, נוכל לבדוק האם או לא gyrus משוננת היה גזור במדויק על ידי ניצוח כזה פשוט בזמן אמת ניסויים PCR.
שלישית, על מנת להעריך את התועלת של שיטה זו לנתיחה, השווינו את ביטוי ה-mRNA ברמה של ההיפוקמפוס שלם עם זה של gyrus משוננת. ההיפוקמפוס שלמים gyrus משוננת המתקבל wild-type (= 9 ו - 4, של n בהתאמה) אלפא CaMKII + / - העכברים (= n של 18 ו - 4, בהתאמה) עובדו לניתוח microarray, ועל גנים כל הבקיע, מתקפלת השינוי מחושב על ידי חלוקת שווי מוטציה לפי ערך wild-type. התוצאות הראו כי שינויים בביטוי mRNA, במיוחד של משוננת gyrus מולקולות ספציפיות כגון DSP ו TDO2, התגלו עם עלייה של 5 עד פי ברגישות בדגימות gyrus משוננת לעומת דגימות בהיפוקמפוס כולה (טבלה 1). אנחנו בעבר הראו כי אלפא CaMKII + / - עכברים התנהגויות התערוכה הקשורים בהפרעות פסיכיאטריות אדם כגון גירעונות זיכרון העבודה קצב infradian מוגזם 1,5. יתר על כן, תכונות מורפולוגיים ו אלקטרו של נוירונים gyrus משוננת בעכברים מוטנטים דומים להפליא לאלה של בוגרים הנוירונים gyrus משוננת במכרסמים נורמלי, המציין כי הנוירונים האלה עכברים שעברו מוטציה אינם מצליחים לפתח לפדיון 1. הביטוי בשלה משוננת gyrus ולמטה מוסדר של DSP ו TDO2 mRNA של אלפא CaMKII + / - העכברים עולים בקנה אחד עם הממצא שלפיו DSP ו TDO2 יכול לשמש סמנים של תאים גרגר בוגרים gyrus משוננת (Ohira ואח', טרם פורסם. נתונים).
יחדיו, טכניקה זו לנתיחה נוח ומדויק ניתן להשתמש באופן אמין ללימודי התמקדו gyrus משוננת. רקמה gyrus משוננת שהושגו בשיטה זו הוא ישים סוגים אחרים של ניתוחים וכן, כולל ניתוחים proteomic ביולוגיה של התא.
באיור 1. אימות gyrus משוננת מבודד על ידי מחקר היסטולוגית. קטע העטרה של המוח לאחר בידוד gyrus משוננת היה מעובד עבור מכתים Nissl (הפאנל השמאלי), וכן תרשים סכמטי עיבוד במוח העכבר atlas6 מייצג את בערך אותה רמה של סעיף המופיע בלוח השמאלי (פאנל מימין). החצים מצביעים על כיווני הכניסה מחט קצה. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ.
איור 2. אימות gyrus משוננת מבודד על ידי ה-PCR בזמן אמת. Gyrus משוננת ו הקרן של עמון השיג ארבעה wild-type עכברים עובדו בזמן אמת PCR של ביתא אקטין, TDO2, DSP, Mrg1b ו Tyro3. תוצאות מוצגים כאמצעי ± SEM. לניתוח סטטיסטי, לא של סטודנטים מבחן הועסק, וערכים p הם אחריו: ביתא אקטין, p = 0.11; TDO2, p = 0.000023 (** 1); DSP, p = 0.0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3); ו Tyro3, p = 0.00017 (** 4).
טבלה 1. . ניתוח microarray של ההיפוקמפוס שלם gyrus משוננת גנים הביע דיפרנציאלי ב gyrus משוננת ו ההיפוקמפוס שלם של אלפא CaMKII + / - עכברים נקבעו על ידי חישוב השינוי מתקפלת מזה זוהה wild-type עכברים. הנתונים נותחו על מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t של סטודנט בין wild-type ו אלפא CaMKII + / - עכברים. בין הגנים של ביטוי אשר הציג p <0.05 בgyrus משוננת של אלפא CaMKII + / - העכברים בהשוואה לזו של wild-type עכברים, העליון 50 גנים מפורטים. שימו לב למספרים של דגימות עבור gyrus משוננת הרבה פחות מאלו של ההיפוקמפוס כולו. AffyID, Affymetrix בדיקה המזהה; CKII, אלפא CaMKII + / - עכברים, WT, wild-type עכברים.
| משוננת gyrus (p <0.05) WT: n = 4, CKII + / -: n = 4 | שלמות ההיפוקמפוס WT: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| ג'ין כותרת | Genebank | AffyID | מקפלים שינוי | p ערך | מקפלים שינוי | p ערך | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | .011018913 | 7.02694E-06 | .037021003 | 1.86126E-13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | .014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| טריפטופן 2,3-dioxygenase | AI098840 | 1419093_at | .020986484 | 5.23546E-09 | .101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | .075479901 | 1.05191E-08 | .234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | .079457767 | 1.40433E-07 | .177974715 | 3.9758E-12 | ||
| thyrotropin שחרור ההורמון לקולטן | M59811 | 1449571_at | .103105815 | .003093796 | .801412732 | .283994361 | ||
| ryanodine קולטן 1, שרירי השלד | X83932 | 1427306_at | .104825517 | 3.38513E-07 | .650685017 | .000308462 | ||
| סליל nescient לולאה סליל 1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4.078815314 | 5.27E-11 | ||
| copine משפחה חבר IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1.797304153 | .000296375 | ||
| doublecortin כמו קינאז 3 | BB326709 | 1436532_at | .109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| calpain 3 | AF127766 | 1426043_a_at | .111269769 | 8.07053E-06 | .370956608 | 2.04421E-14 | ||
| למבוגרים בסטריאטום זכר קורפוס cDNA, RIKEN באורך מלא מועשר ספריה, שיבוט: C030023B07 המוצר: רצף בלתי ניתן לסיווג, הכנס מלא | BB357628 | 1460043_at | .118712341 | 6.16926E-07 | .682339204 | 2.33001E-06 | ||
| קולגן וסידן EGF מחייב תחומים 1 | AV264768 | 1437385_at | .124043978 | 3.65669E-05 | .488394112 | 4.05538E-06 | ||
| עמילואיד (A4) חלבון מחייב מבשר, משפחה, 2 חבר חלבון מחייב | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2.099164713 | 1.67047E-06 | ||
| calbindin-28K | BB177770 | 1456934_at | .130255444 | 3.32186E-06 | .572605751 | 1.99157E-10 | ||
| תעתיק מוקד | AV328597 | 1443322_at | .133290835 | 5.43583E-06 | .562767164 | 7.56544E-06 | ||
| neuropeptide Y קולטן Y2 | NM_008731 | 1417489_at | .135319609 | .000113407 | .781498474 | 0.00394504 | ||
| ראס חלבון אלמנט מחייב תגובה 1 | BE197381 | 1428657_at | .138235114 | 7.93691E-07 | .651220705 | 2.94209E-05 | ||
| קו תא גלייה נגזרת קולטן neurotrophic המשפחה גורם אלפא 2 | BB284482 | 1433716_x_at | .139062563 | 2.35371E-06 | .669544709 | .000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1.766018828 | .000250501 | ||
| RIKEN גן 1810010H24 cDNA | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| ryanodine קולטן 1, שרירי השלד | BG793713 | 1457347_at | .151364292 | 3.35612E-05 | .503144617 | 4.32907E-05 | ||
| protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | .152671849 | 8.57783E-06 | .670714726 | 1.56309E-05 | ||
| cornichon homolog 3 (דרוזופילה) | NM_028408 | 1419517_at | .153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | .661055608 | ||
| חרקירי, BCL2 חלבון אינטראקציה (מכיל רק BH3 תחום) | BQ175572 | 1439854_at | .154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| פחמימות (N-acetylgalactosamine 4-0) sulfotransferase 9 | AK017407 | 1431897_at | .155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | .215637733 | ||
| calpain 3 | AI323605 | 1433681_x_at | .160871988 | 1.07655E-05 | .477164757 | 1.33753E-11 | ||
| אצבע אבץ, תחום CCHC המכיל 5 | BQ126004 | 1437355_at | .161812078 | 3.08262E-06 | .421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | .165129967 | 1.86362E-05 | .639733409 | .000729772 | ||
| מגיבה 1, (f-מגיבה) חלבון תאי מטריקס | BC020531 | 1451342_at | .168035879 | 6.67867E-07 | .821042412 | .023650765 | ||
| RIKEN גן cDNA A930035E12 | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1.470383201 | .104085454 | ||
| BB247294 RIKEN באורך מלא מועשר, 7 ימים הילוד המוח הקטן Mus שריר שיבוט cDNA, A730018G18 3 'רצף ה-mRNA. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1.968147585 | 0.00010636 | ||
| תחום FERM המכיל 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | .000345581 | 2.780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2.652516957 | .000206279 | |||
| תעתיק רצפים | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1.296248831 | 0.22870031 | ||
| מגיבה 1, (f-מגיבה) חלבון תאי מטריקס | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | .836181248 | .001380141 | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1448738_at | .180317904 | 1.35961E-05 | .647334052 | 4.12268E-09 | ||
| MARCKS כמו 1 | AV110584 | 1437226_x_at | .186235935 | 1.47067E-06 | .499291387 | 2.34984E-08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | .187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | .282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | .188195795 | .000105295 | .915528892 | 0.35282097 | ||
| מגיבה 1, (f-מגיבה) חלבון תאי מטריקס | BQ175871 | 1442613_at | .189956563 | 9.41195E-06 | .861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestin 3, רשתית | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3.944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN גן cDNA A330050F15 | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | .000119342 | .660282035 | 2.47342E-05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | .194404608 | 4.08641E-07 | .918742591 | .022545297 | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1417504_at | .196381321 | 2.24182E-05 | .619305124 | 3.6222E-06 | ||
| gastrin שחרור פפטיד | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2.752845903 | 5.72954E-07 | ||
| sortilin הקשורות VPS10 תחום המכיל קולטן 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | .029733649 | ||
| קולטן דופמין D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1.815881979 | .000516498 | ||
| proprotein convertase subtilisin / kexin סוג 5 | BB241731 | 1437339_s_at | .210528027 | 7.83039E-05 | .574126078 | 9.15496E-05 | ||
| אינטרלוקין 1 receptor, סוג אני | NM_008362 | 1448950_at | .210572243 | 9.64524E-06 | .241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי המכון הלאומי מדריך הבריאות טיפול ושימוש בחיות מעבדה, ואושר על ידי טיפול בבעלי חיים ועדה להשתמש ב Fujita בריאות האוניברסיטה.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר יוקו Nabeshima ב אוניברסיטת קיוטו הוראה שלה על הטכניקה לנתיחה וגב 'אקי Miyakawa ב Fujita הבריאות באוניברסיטת התמיכה שלה בסרט. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית לקידום לימודי יסוד במדעי הבריאות של המכון הלאומי של חדשנות ביו, גרנט-in-Aid למחקר מדעי על אזורי עדיפות-אינטגרטיבית לחקר המוח (Shien) - החל MEXT ביפן, ועל ידי גרנט-in-Aid מפסגת של המדע והטכנולוגיה ביפן הסוכנות.
References
- Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
- Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
- Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
- Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
- Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press Inc.. San Diego. (1997).
