Summary
一个去除从成年小鼠齿状回立体显微镜下解剖技术被证明在这个录像的协议。
Abstract
海马是大脑中最广泛的研究领域，由于其重要的职能作用，在内存中处理和学习，其显着的神经元细胞的可塑性，并参与癫痫，神经退行性疾病和精神疾病之一。海马是不同的区域组成，其中主要包括颗粒神经元，阿蒙的号角，其中主要包括锥体神经元，和这两个地区的齿状回，解剖和功能的电路连接。许多不同的mRNA和蛋白质的选择性表达齿状回，齿状回的成年神经发生的部位，也就是新的神经细胞不断产生在成年齿状回。探讨具体齿状回的mRNA和蛋白表达，激光捕获显微切割经常被使用。这种方法有一定局限性，但是，如需要特殊仪器和复杂的处理程序。在这个录像协议中，我们展示了一个从成年鼠的体视显微镜下齿状回的夹层技术。齿状回，准备使用这种技术的样本，适用于任何实验，包括转录组，蛋白质组和细胞生物学分析。我们确认，解剖组织进行实时PCR齿状回的特定基因，色氨酸2,3 - 双加氧酶（TDO2）和desmoplakin（DSP），和亚扪人的号角丰富的基因，MEIS相关基因1B（Mrg1b齿状回）和TYRO3酪氨酸蛋白激酶3（Tyro3）。 TDO2和DSP在齿状回样品的mRNA的表达明显较高的水平，而Mrg1b和Tyro3水平较低，比那些在阿蒙的号角样本，检测。为了证明这种方法的优点，我们进行DNA芯片分析整个海马及齿状回的样品。 TDO2和DSP的mRNA的表达，是在齿状回表达选择性在整个海马的α- CaMKII / - 小鼠，展出分别为0.037和野生型小鼠相比，0.10倍的变化。然而，在孤立的齿状回，这些表达式展出0.011和0.021倍的变化，野生型小鼠相比，表明在齿状回的基因表达的变化，可以用更高的灵敏度检测。两者合计，这个方便，准确的夹层技术可以可靠地用于研究侧重于齿状回。
Protocol
海马齿状回的剖析
- 在深度麻醉的鼠标，仔细解剖大脑从头骨，放入冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 含有冰冷的PBS在培养皿菜，切沿大脑纵裂的大脑使用手术刀，切断后的lambda（中脑，后脑和小脑）的地区。
- 将大脑半球的内侧，使用镊子，小心地取出一个夹层显微镜下的间脑（丘脑和下丘脑）。这将会使内侧的海马，齿状回的可视化。齿状回阿蒙的角分辨它们之间的差距。海马损伤或周边地区，将使其更难以隔离齿状回。
- 插入到的齿状回（在齿状回和阿蒙的角界限;图1）两侧的一个尖锐的针，针尖（例如，27 - 压力表针），和幻灯片沿的海马septo的时空轴针表面隔离齿状回。
- 拿起孤立的齿状回用针或镊子，并放置在一个样品管。因此获得的齿状回组织样本可立即使用任何检测或存储在深冷冻供日后使用。
- 隔离用同样的方法从其他脑半球的齿状回。
实时定量PCR
齿状回分离使用上述的方法，其余海马解剖阿蒙的从野生型小鼠的号角样本。 β-肌动蛋白，TDO2，DSP Mrg1b和Tyro3实时PCR技术进行了齿状回和阿蒙的号角样本描述以前1。引物5' - CTGGCGAGATCACGATGACG和5' - AAGCTACGCTGTTGTCTAACC用于Mrg1b，GCCTCCAAATTGCCCGTCA和5' - CCAGCACTGGTACATGAGATCA Tyro3。
微阵列分析
微阵列实验与男性的野生型小鼠和小鼠钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα-异构体的杂合子（α- CaMKII + / -小鼠）以前1。简单地说，从整个海马齿状回或野生型和突变型小鼠中分离出的RNA杂交小鼠基因组430 2.0阵列（Affymetrix公司，美国加州圣克拉拉市），每个基因芯片是由Affymetrix基因芯片扫描仪3000（GCS3000）扫描。基因芯片与芯片分析套件5.0版进行分析。
Discussion
齿状回海马2,3卷中占有约25％至30％ 。它具有独特的细胞组成，并在不同的大脑功能起着至关重要的作用。因此，隔离齿状回的技术分析特别是在这一地区发生的事件非常有用。
在这里，我们展示了一个过程，有效地解剖从成年小鼠海马齿状回，并确认该技术的精度。首先，组织学研究表明，齿状回分离没有其他地区的污染（图1），这表明可以准备一个纯粹的齿状回样本。
其次，我们确认解剖组织齿状回进行实时PCR齿状回特定的基因，TDO2和DSP，并亚扪人的号角丰富的基因，Mrg1b Tyro3 4（图2） 。对TDO2的基因表达式（p = 0.000023; n的分别= 4）和DSP（p = 0.0000030; n的分别= 4）的齿状回的样品被检测到明显较高的水平，而Mrg1b（p = 0.000080，N = 4和4）和Tyro3（P = 0.00017; n的= 4和4）分别较低的水平，比那些在阿蒙的号角样本。 β-肌动蛋白的表达水平没有差异，在这些样本（P = 0.11，N = 4和4个，分别）。因此，我们可以检查是否齿状回准确的解剖进行这种简单的实时PCR实验。
第三，以评估这一解剖方法的有效性，我们比较了整个海马齿状回的mRNA表达水平。全海马和齿状回野生的类型（n的= 9和4，分别）和ALPHA - CaMKII /获得 - 小鼠（n的= 18和4，分别）是芯片分析处理，并为所有基因的得分，在倍，变化是由野生型的值除以突变值计算。结果表明，mRNA表达的变化，特别是齿状回特定的分子，如DSP和TDO2，检测齿状回样品的灵敏度在整个海马样本（见表1）相比增加了5倍。我们以前表明，α- CaMKII + / -小鼠表现出的行为与人类精神失常，如工作记忆障碍和夸张infradian 节奏 1,5 。此外，突变小鼠齿状回神经元的形态和电生理功能不成熟齿状回神经元在正常老鼠惊人地相似，表明这些突变小鼠的神经元没有发展到成熟1。未成熟的齿状回和下调表达的DSP和TDO2 ALPHA - CaMKII表达+ / - 小鼠是符合的，DSP和TDO2可以被作为成熟颗粒细胞的标记使用的齿状回（大平等人发现，未发表。数据）。
两者合计，这个方便，准确的夹层技术可以可靠地用于研究侧重于齿状回。使用这种方法获得的齿状回组织是适用于其他类型的分析，包括蛋白质组学和细胞生物学分析。
图1。验证孤立的组织学研究的齿状回。尼氏染色（左图），和一个大脑后隔离齿状回的冠状断面处理示意图改编自小鼠大脑atlas6代表约在左侧面板中（右图）所示的部分相同的水平。箭头指示插入针尖的方向。比例尺，1毫米。
图2隔离齿状回实时PCR验证。齿状回和阿蒙小号喇叭从四个野生型小鼠的β-肌动蛋白，实时定量PCR TDO2，器Mrg1b和Tyro3处理。结果是± SEM手段。进行统计分析，采用S T检验，P值均遵循：β-肌动蛋白，P = 0.11; TDO2，P = 0.000023（** 1）; DSP，P = 0.0000030（** 2）; Mrg1b ，P = 0.000080 **（3）; Tyro3，P = 0.00017（** 4）。
表1。整个海马和齿状回的微阵列分析基因差异表达α- CaMKII整个海马齿状回和+ / -小鼠，通过计算在野生型小鼠中检测到的折叠变化来确定。统计学生S T测试的意义之间使用野生型和α- CaMKII + / -小鼠的数据进行了分析。其中的基因，其表达展出P <0.05在α- CaMKII + / - 小鼠比野生型小鼠齿状回，前50个基因被列出。请注意，远远低于整个海马齿状回的样本数量。 AffyID，Affymetrix的探针标识符; CKII，α- CaMKII + / - 小鼠，野生型，野生型小鼠。
| 齿状回（P <0.05） WT：N = 4，CKII + / - ：N = 4 | 整个海马 WT：N = 9，CKII + / - ：N = 18 | |||||||
| 基因标题 | 基因库 | AffyID | 折叠变化 | P值 | 折叠变化 | P值 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | 0.011018913 | 7.02694E - 06 | 0.037021003 | 1.86126E - 13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0.014369734 | 7.86747E - 06 | 0.04232106 | 1.00579E - 12 | ||
| 色氨酸2,3 - 双加氧酶 | AI098840 | 1419093_at | 0.020986484 | 5.23546E - 09 | 0.101037776 | 4.14823E - 13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0.075479901 | 1.05191E - 08 | 0.234001154 | 1.66301E - 15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0.079457767 | 1.40433E - 07 | 0.177974715 | 3.9758E - 12 | ||
| 促甲状腺激素释放激素受体 | M59811 | 1449571_at | 0.103105815 | 0.003093796 | 0.801412732 | 0.283994361 | ||
| 1，骨骼肌ryanodine受体 | X83932 | 1427306_at | 0.104825517 | 3.38513E - 07 | 0.650685017 | 0.000308462 | ||
| nescient螺旋环螺旋1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E - 06 | 4.078815314 | 5.27E - 11 | ||
| COPINE家庭成员九 | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E - 06 | 1.797304153 | 0.000296375 | ||
| doublecortin - 3激酶 | BB326709 | 1436532_at | 0.109336662 | 1.95278E - 07 | 0.56697229 | 2.62633E - 08 | ||
| 蛋白酶3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0.111269769 | 8.07053E - 06 | 0.370956608 | 2.04421E - 14 | ||
| 成年男性纹状体的cDNA全长，日本理化学研究所丰富的图书馆，克隆：C030023B07产品：不能分类，插入序列 | BB357628 | 1460043_at | 0.118712341 | 6.16926E - 07 | 0.682339204 | 2.33001E - 06 | ||
| 胶原蛋白和钙离子结合表皮生长因子域1 | AV264768 | 1437385_at | 0.124043978 | 3.65669E - 05 | 0.488394112 | 4.05538E - 06 | ||
| β淀粉样蛋白（A4）的前体蛋白结合，一个家庭，成员2结合蛋白 | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E - 06 | 2.099164713 | 1.67047E - 06 | ||
| calbindin - 28K | BB177770 | 1456934_at | 0.130255444 | 3.32186E - 06 | 0.572605751 | 1.99157E - 10 | ||
| 转录位点 | AV328597 | 1443322_at | 0.133290835 | 5.43583E - 06 | 0.562767164 | 7.56544E - 06 | ||
| 神经肽Y受体Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0.135319609 | 0.000113407 | 0.781498474 | 0.00394504 | ||
| ras基因反应元件结合蛋白1 | BE197381 | 1428657_at | 0.138235114 | 7.93691E - 07 | 0.651220705 | 2.94209E - 05 | ||
| 胶质细胞源性神经营养因子家族受体的阿尔法2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0.139062563 | 2.35371E - 06 | 0.669544709 | 0.000214146 | ||
| 脑啡肽1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E - 08 | 1.766018828 | 0.000250501 | ||
| 日本理化学研究所基因1810010H24基因 | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E - 05 | 2.77573142 | 6.81865E - 09 | ||
| 1，骨骼肌ryanodine受体 | BG793713 | 1457347_at | 0.151364292 | 3.35612E - 05 | 0.503144617 | 4.32907E - 05 | ||
| protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0.152671849 | 8.57783E - 06 | 0.670714726 | 1.56309E - 05 | ||
| cornichon同源3（果蝇） | NM_028408 | 1419517_at | 0.153724144 | 8.90755E - 06 | 0.95780695 | 0.661055608 | ||
| harakiri，BCL2基因相互作用蛋白（只包含BH3结构域） | BQ175572 | 1439854_at | 0.154284407 | 2.0118E - 05 | 0.56516812 | 4.86925E - 09 | ||
| 碳水化合物（4-0）磺基转移酶的N -乙酰9 | AK017407 | 1431897_at | 0.155238951 | 5.37423E - 06 | 1.14910007 | 0.215637733 | ||
| 蛋白酶3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0.160871988 | 1.07655E - 05 | 0.477164757 | 1.33753E - 11 | ||
| 锌指，远洋域含5 | BQ126004 | 1437355_at | 0.161812078 | 3.08262E - 06 | 0.421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0.165129967 | 1.86362E - 05 | 0.639733409 | 0.000729772 | ||
| spondin 1，（F - spondin）细胞外基质蛋白 | BC020531 | 1451342_at | 0.168035879 | 6.67867E - 07 | 0.821042412 | 0.023650765 | ||
| 日本理化学研究所基因A930035E12基因 | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E - 07 | 1.470383201 | 0.104085454 | ||
| BB247294日本理化学研究所全长丰富，7天的新生儿小脑小家鼠的cDNA克隆A730018G18 3'，mRNA序列。 | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E - 05 | 1.968147585 | 0.00010636 | ||
| FERM域包含3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0.000345581 | 2.780297178 | 1.83072E - 06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E - 06 | 2.652516957 | 0.000206279 | |||
| 转录序列 | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E - 06 | 1.296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1，（F - spondin）细胞外基质蛋白 | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E - 06 | 0.836181248 | 0.001380141 | ||
| calbindin - 28K | BB246032 | 1448738_at | 0.180317904 | 1.35961E - 05 | 0.647334052 | 4.12268E - 09 | ||
| MARCKS，像1 | AV110584 | 1437226_x_at | 0.186235935 | 1.47067E - 06 | 0.499291387 | 2.34984E - 08 | ||
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| 3休止，视网膜 | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E - 05 | 3.944218329 | 1.07437E - 07 | ||
| 日本理化学研究所基因A330050F15基因 | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0.000119342 | 0.660282035 | 2.47342E - 05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0.194404608 | 4.08641E - 07 | 0.918742591 | 0.022545297 | ||
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| 胃泌素释放肽 | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E - 05 | 2.752845903 | 5.72954E - 07 | ||
| sortilin相关VPS10域受体3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E - 05 | 1.29051599 | 0.029733649 | ||
| 多巴胺受体D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E - 05 | 1.815881979 | 0.000516498 | ||
| proprotein convertase枯草杆菌/可心类型5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0.210528027 | 7.83039E - 05 | 0.574126078 | 9.15496E - 05 | ||
| 白细胞介素1受体，I型 | NM_008362 | 1448950_at | 0.210572243 | 9.64524E - 06 | 0.241135352 | 2.79816E - 08 | ||
Disclosures
按照实验动物护理和使用指南“国家卫生研究所进行了动物实验，和藤田保健大学动物护理和使用委员会的批准。
Acknowledgments
我们感谢她的解剖技术和支持她的电影的女士亚希藤田保健大学宫川指令京都大学博士洋子锅岛。这项工作是促进基础研究的国家生物医药创新，为科学研究的优先领域，结合脑研究（师恩）赠款援助研究所健康科学计划 - 从日本文部科学省和支持一个格兰特 - 日本科学技术振兴机构佳洁士援助。
References
- Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
- Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
- Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
- Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
- Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press Inc.. San Diego. (1997).
