Summary
Een dissectie techniek voor het verwijderen van de dentate gyrus van volwassen muis onder een stereomicroscoop werd aangetoond in deze video opgenomen protocol.
Abstract
De hippocampus is een van de meest bestudeerde gebieden in de hersenen vanwege zijn belangrijke functionele rol in het geheugen en het leren verwerken, zijn opmerkelijke neuronale plasticiteit cel, en de betrokkenheid bij epilepsie, neurodegeneratieve ziekten, en psychiatrische stoornissen. De hippocampus is samengesteld uit verschillende regio's, de dentate gyrus, die voornamelijk bestaat uit korrels neuronen, en Ammon de hoorn, die voornamelijk bestaat uit piramidale neuronen, en de twee regio's zijn verbonden door zowel de anatomische en functionele circuits. Veel verschillende mRNA's en eiwitten worden selectief uitgedrukt in de dentate gyrus en de dentate gyrus is een site van volwassen neurogenese, dat wil zeggen nieuwe neuronen worden voortdurend gegenereerd in de volwassen dentate gyrus. Om te onderzoeken mRNA en eiwit expressie die specifiek zijn voor de dentate gyrus, is laser capture microdissectie vaak gebruikt. Deze methode heeft een aantal beperkingen, echter, zoals de noodzaak van speciale apparaten en ingewikkelde procedures voor de behandeling. In deze video opgenomen protocol, demonstreren we een dissectie techniek voor het verwijderen van de dentate gyrus van volwassen muis onder een stereomicroscoop. Dentate gyrus monsters bereid met behulp van deze techniek geschikt zijn voor een test, inclusief transcriptoom, proteoom, en celbiologie analyses. We hebben bevestigd dat de ontleedde weefsel dentate gyrus door het uitvoeren van real-time PCR van de dentate gyrus-specifieke genen, tryptofaan 2,3-dioxygenase (TDO2) en desmoplakin (DSP), en Ammon de hoorn verrijkt genen, Meis-gerelateerde gen 1b (Mrg1b ) en TYRO3 proteïne tyrosine kinase 3 (Tyro3). De mRNA expressie van TDO2 en DSP in de dentate gyrus monsters werden gedetecteerd bij duidelijk hogere niveaus, terwijl de Mrg1b en Tyro3 waren een lager niveau, dan die in hoorn van de Ammons monsters. Om aan te tonen het voordeel van deze methode, we voeren DNA microarray analyse met behulp van monsters van hele hippocampus en de dentate gyrus. De mRNA expressie van TDO2 en DSP, die selectief worden uitgedrukt in de dentate gyrus, in de hele hippocampus van alfa-CaMKII + / - muizen, tentoongesteld 0,037 en 0,10-voudige wijzigingen ten opzichte van die van de wild-type muizen, respectievelijk. In de geïsoleerde dentate gyrus, maar deze uitdrukkingen tentoongesteld 0.011 en de 0.021-voudig wijzigingen ten opzichte van die van de wild-type muizen, waaruit blijkt dat de genexpressie veranderingen in de dentate gyrus kunnen worden gedetecteerd met een grotere gevoeligheid. Bij elkaar genomen, kan dit gemakkelijke en nauwkeurige dissectie techniek betrouwbaar kunnen worden gebruikt voor onderzoek gericht op de dentate gyrus.
Protocol
Dissectie van de hippocampus dentate gyrus
- In een diep onder narcose muis, zorgvuldig ontleden de hersenen uit de schedel en plaats het in de ijskoude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- In een petrischaal met ijskoud PBS, snijd de hersenen in de lengterichting spleet van de grote hersenen met behulp van een chirurgisch mes, en sneed de regio's achterste te lambda (middenhersenen, achterhersenen, en het cerebellum).
- Plaats de hersenhelft mediale zijde omhoog en met behulp van tang, verwijder voorzichtig de diencephalon (thalamus en hypothalamus) onder een dissectie microscoop. Dit zal blootstellen de mediale zijde van de hippocampus, waardoor visualisatie van de dentate gyrus. De dentate gyrus is te onderscheiden van hoorn Ammons door de kloof tussen hen. Schade aan de hippocampus of de omliggende omgeving maken het moeilijker om de dentate gyrus isoleren.
- Plaats een scherpe naald-tip (bv. 27-gauge naald) in elke kant van de dentate gyrus (grenzen van de dentate gyrus en Ammon hoorn; figuur 1), en oppervlakkig schuif de naalden langs de Septo-temporele as van hippocampus te isoleren de dentate gyrus.
- Pak de geïsoleerde dentate gyrus met behulp van een naald of pincet en plaats deze in een monster buis. De aldus verkregen dentate gyrus weefselmonster kan direct worden gebruikt voor elke test of opgeslagen in een diepvriezer voor later gebruik.
- Isoleer de dentate gyrus van de andere hersenhelft met behulp van dezelfde methode.
Kwantitatieve real-time PCR
De dentate gyrus werd geïsoleerd met behulp van de hierboven genoemde methode en de resterende hippocampus werd ontleed uit als hoorn van de Ammons monster van wild-type muizen. Real-time PCR van beta-actine, TDO2, DSP, Mrg1b en Tyro3 werden uitgevoerd met de dentate gyrus en de Ammons hoorn monsters zoals eerder is beschreven: 1. Primers 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG en 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC werden gebruikt voor Mrg1b en GCCTCCAAATTGCCCGTCA en 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA voor Tyro3.
Microarray analyse
Microarray experimenten werden uitgevoerd met mannelijke wild-type muizen en muizen heterozygoot voor de alfa-isovorm van calcium / calmoduline-afhankelijke proteïne kinase II (alpha-CaMKII + / - muizen) zoals eerder beschreven: 1. In het kort werd RNA geïsoleerd uit de hele hippocampus of de dentate gyrus van de wild-type en mutante muizen gehybridiseerd met een muis Genome 430 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA), en elke GeneChip werd gescand door een Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (GCS3000) . GeneChip analyse werd uitgevoerd met Microarray Analysis Suite versie 5.0.
Discussion
De dentate gyrus neemt ongeveer 25% tot 30% van het volume van de hippocampus formatie 2,3. Het heeft een unieke samenstelling cel en speelt cruciale rol in diverse hersenfuncties. Dan ook, technieken om de dentate gyrus te isoleren zijn nuttig voor het analyseren van de gebeurtenissen die specifiek optreden in deze regio.
Hier hebben we laten zien een procedure om efficiënt ontleden van de dentate gyrus van de volwassen muis hippocampus en bevestigde de precisie van de techniek. De eerste, histologisch onderzoek bleek dat de dentate gyrus werd afgescheiden zonder besmetting door andere regio's (figuur 1), wat aangeeft dat een zuiver dentate gyrus monster kan worden bereid.
Ten tweede hebben we bevestigd dat de ontleedde weefsel dentate gyrus door het uitvoeren van real-time PCR van de dentate gyrus-specifieke genen, TDO2 en DSP, en Ammon de hoorn verrijkt genen, Mrg1b en Tyro3 4 (figuur 2). De mRNA expressie van TDO2 (p = 0,000023; n's = 4 en 4, respectievelijk) en DSP (p = 0,0000030; n's = 4 en 4, respectievelijk) in de dentate gyrus monsters werden gedetecteerd bij duidelijk hogere niveaus, terwijl Mrg1b (p = 0.000080, n's = 4 en 4, respectievelijk) en Tyro3 (p = 0,00017; N = 4 en 4, respectievelijk) waren een lager niveau, dan die in hoorn van de Ammons monsters. Beta-actine expressie niveaus verschilden niet in deze monsters (p = 0,11; N = 4 en 4, respectievelijk). Zo kunnen we controleren of de dentate gyrus juist is ontleed door het uitvoeren van dergelijke eenvoudige real-time PCR experimenten.
Ten derde, het nut van deze dissectie methode te beoordelen, vergeleken we de mRNA expressie niveau van de gehele hippocampus met die van dentate gyrus. Hele hippocampus en dentate gyrus afkomstig van wild-type (n's = 9 en 4, respectievelijk) en alfa-CaMKII + / - muizen (n's = 18 en 4, respectievelijk) werden verwerkt voor microarray analyse, en voor alle genen gescoord, de vouw- verandering werd berekend door de mutant waarde door de wild-type waarde. De resultaten gaven aan dat de veranderingen in mRNA expressie, in het bijzonder van de dentate gyrus-specifieke moleculen zoals DSP en TDO2, werden gedetecteerd met een tot 5-voudige toename van de gevoeligheid van dentate gyrus monsters in vergelijking met heel hippocampus monsters (tabel 1). We hebben eerder aangetoond dat alfa-CaMKII + / - muizen vertonen gedragingen die verband houden met de menselijke psychiatrische stoornissen, zoals werkgeheugen tekorten en een overdreven infradian ritme 1,5. Bovendien, morfologische en de elektrofysiologische eigenschappen van de dentate gyrus neuronen in mutante muizen zijn opvallend vergelijkbaar met die van onvolwassen dentate gyrus neuronen in de normale knaagdieren, wat aangeeft dat de neuronen in deze mutante muizen niet uitgroeien tot volgroeide 1. De onvolwassen dentate gyrus en de down-gereguleerde expressie van DSP en TDO2 mRNA in alpha-CaMKII + / - muizen zijn in overeenstemming met de bevinding dat DSP en TDO2 kan worden gebruikt als markers van volwassen granule cellen in de dentate gyrus (Ohira et al., niet gepubliceerd. gegevens).
Bij elkaar genomen, kan dit gemakkelijke en nauwkeurige dissectie techniek betrouwbaar kunnen worden gebruikt voor onderzoek gericht op de dentate gyrus. Dentate gyrus weefsel verkregen met behulp van deze methode is van toepassing op andere soorten analyses ook, met inbegrip proteomische en celbiologie analyses.
Figuur 1. Verificatie van het geïsoleerde dentate gyrus door histologische studie. Een coronale deel van de hersenen na het isoleren van dentate gyrus was verwerkt voor Nissl vlekken (linker paneel), en een schematisch diagram aangepast van de hersenen van muizen atlas6 vertegenwoordigt de ongeveer hetzelfde niveau van de sectie getoond in het linker paneel (rechter paneel). Pijlen geven de richting van de naald-tip inbrengen. Schaal bar, 1 mm.
Figuur 2. Verificatie van het geïsoleerde dentate gyrus door real-time PCR. De dentate gyrus en de Ammon s hoorn afkomstig van vier wild-type muizen werden verwerkt voor real-time PCR van beta-actine, TDO2, DSP, Mrg1b en Tyro3. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelden ± SEM. Voor statistische analyse, was Student t test s in dienst, en p-waarden worden gevolgd: beta-actine, p = 0,11; TDO2, p = 0,000023 (** 1), DSP, p = 0.0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3), en Tyro3, p = 0,00017 (** 4).
Tabel 1. . Microarray analyse van de gehele hippocampus en de dentate gyrus genen differentieel tot expressie in de dentate gyrus en hele hippocampus van alfa-CaMKII + / - muizen werden bepaald door het berekenen van de fold-change van die gedetecteerd in wild-type muizen. De gegevens werden geanalyseerd voor statistische significantie met behulp van de Student T-test tussen de wild-type en de alpha-CaMKII + / - muizen. Onder de genen waarvan de expressie tentoongesteld p <0,05 inde dentate gyrus van alfa-CaMKII + / - muizen vergeleken met die van wild-type muizen, zijn de top 50 genen vermeld. Merk op dat de aantallen monsters voor dentate gyrus zijn veel minder zijn dan die voor hele hippocampus. AffyID, Affymetrix sonde identifier, CKII, alpha-CaMKII + / - muizen, WT, wild-type muizen.
| Dentate gyrus (p <0,05) WT: n = 4, CKII + / -: n = 4 | Hele hippocampus WT: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| Gen titel | Genenbank | AffyID | Voudige verandering | p-waarde | Voudige verandering | p-waarde | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | 0,011018913 | 7.02694E-06 | 0,037021003 | 1.86126E-13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0,014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| tryptofaan 2,3-dioxygenase | AI098840 | 1419093_at | 0,020986484 | 5.23546E-09 | 0,101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0,075479901 | 1.05191E-08 | 0,234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0,079457767 | 1.40433E-07 | 0,177974715 | 3.9758E-12 | ||
| thyrotropine releasing hormoon receptor | M59811 | 1449571_at | 0,103105815 | 0,003093796 | 0,801412732 | 0,283994361 | ||
| ryanodine receptor 1, skeletspieren | X83932 | 1427306_at | 0,104825517 | 3.38513E-07 | 0,650685017 | 0,000308462 | ||
| agnostisch helix-lus-helix een | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4,078815314 | 5.27E-11 | ||
| Copine familielid IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1,797304153 | 0,000296375 | ||
| doublecortin-like kinase 3 | BB326709 | 1436532_at | 0,109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| calpaïne 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0,111269769 | 8.07053E-06 | 0,370956608 | 2.04421E-14 | ||
| Volwassen mannelijke corpus striatum cDNA, RIKEN full-length verrijkt bibliotheek, kloon: C030023B07 product: niet te classificeren, vol te voegen volgorde | BB357628 | 1460043_at | 0,118712341 | 6.16926E-07 | 0,682339204 | 2.33001E-06 | ||
| collageen en calcium-bindende EGF domeinen een | AV264768 | 1437385_at | 0,124043978 | 3.65669E-05 | 0,488394112 | 4.05538E-06 | ||
| amyloid beta (A4) precursor eiwit-binding, familie A, lid 2 bindend eiwit | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2,099164713 | 1.67047E-06 | ||
| calbindin-28K | BB177770 | 1456934_at | 0,130255444 | 3.32186E-06 | 0,572605751 | 1.99157E-10 | ||
| Getranscribeerd locus | AV328597 | 1443322_at | 0,133290835 | 5.43583E-06 | 0,562767164 | 7.56544E-06 | ||
| neuropeptide Y-receptor Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0,135319609 | 0,000113407 | 0,781498474 | 0.00394504 | ||
| ras responsief element bindend eiwit een | BE197381 | 1428657_at | 0,138235114 | 7.93691E-07 | 0,651220705 | 2.94209E-05 | ||
| gliale cellijn afgeleide neurotrofe factor familie receptor alpha 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0,139062563 | 2.35371E-06 | 0,669544709 | 0,000214146 | ||
| preproenkephalin een | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1,766018828 | 0,000250501 | ||
| RIKEN cDNA 1810010H24 gen | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| ryanodine receptor 1, skeletspieren | BG793713 | 1457347_at | 0,151364292 | 3.35612E-05 | 0,503144617 | 4.32907E-05 | ||
| protocadherine 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0,152671849 | 8.57783E-06 | 0,670714726 | 1.56309E-05 | ||
| cornichon homoloog 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0,153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | 0,661055608 | ||
| zelfmoord, BCL2 interagerende proteïne (bevat alleen BH3 domein) | BQ175572 | 1439854_at | 0,154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| koolhydraten (N-acetylgalactosamine 4-0) sulfotransferaseactiviteit 9 | AK017407 | 1431897_at | 0,155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | 0,215637733 | ||
| calpaïne 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0,160871988 | 1.07655E-05 | 0,477164757 | 1.33753E-11 | ||
| zinkvinger, CCHC domein met 5 | BQ126004 | 1437355_at | 0,161812078 | 3.08262E-06 | 0,421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0,165129967 | 1.86362E-05 | 0,639733409 | 0,000729772 | ||
| spondin 1, (f-spondin) extracellulaire matrix eiwit | BC020531 | 1451342_at | 0,168035879 | 6.67867E-07 | 0,821042412 | 0,023650765 | ||
| RIKEN cDNA A930035E12 gen | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1,470383201 | 0,104085454 | ||
| BB247294 RIKEN full-length verrijkt, 7 dagen neonaat cerebellum Mus musculus cDNA-kloon A730018G18 3 ', mRNA-sequentie. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1,968147585 | 0.00010636 | ||
| FERM domein met 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0,000345581 | 2,780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2,652516957 | 0,000206279 | |||
| Getranscribeerd sequenties | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1,296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1, (f-spondin) extracellulaire matrix eiwit | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | 0,836181248 | 0,001380141 | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1448738_at | 0,180317904 | 1.35961E-05 | 0,647334052 | 4.12268E-09 | ||
| Marcks-achtige 1 | AV110584 | 1437226_x_at | 0,186235935 | 1.47067E-06 | 0,499291387 | 2.34984E-08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0,187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0,282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0,188195795 | 0,000105295 | 0,915528892 | 0.35282097 | ||
| spondin 1, (f-spondin) extracellulaire matrix eiwit | BQ175871 | 1442613_at | 0,189956563 | 9.41195E-06 | 0,861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestine 3, retinale | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3,944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN cDNA A330050F15 gen | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0,000119342 | 0,660282035 | 2.47342E-05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0,194404608 | 4.08641E-07 | 0,918742591 | 0,022545297 | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1417504_at | 0,196381321 | 2.24182E-05 | 0,619305124 | 3.6222E-06 | ||
| gastrine releasing peptide | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2,752845903 | 5.72954E-07 | ||
| sortilin-gerelateerde VPS10 domein-bevattende receptor 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | 0,029733649 | ||
| dopamine receptor D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1,815881979 | 0,000516498 | ||
| proproteïne convertase subtilisine / kexin type 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0,210528027 | 7.83039E-05 | 0,574126078 | 9.15496E-05 | ||
| interleukine-1 receptor, type I | NM_008362 | 1448950_at | 0,210572243 | 9.64524E-06 | 0,241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
Dieren experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institute of Health Guide voor Zorg en gebruik van proefdieren, en goedgekeurd door het dier zorg en het gebruik comite op Fujita Health University.
Acknowledgments
Wij danken dr. Yoko Nabeshima aan de Universiteit van Kyoto voor haar instructie over de dissectie techniek en mevrouw Aki Miyakawa aan Fujita Health Universiteit voor haar steun aan film. Dit werk werd ondersteund door het Programma voor de bevordering van de fundamentele Studies in Health Sciences van het Nationaal Instituut voor Biomedische Innovatie, een Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek op prioritaire gebieden-Integratieve Brain Research (shien) - van MEXT in Japan, en door een Grant-in-Aid van CREST van de Japan Science and Technology Agency.
References
- Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
- Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
- Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
- Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
- Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press Inc.. San Diego. (1997).
