Summary
Une technique de dissection de l'enlèvement du gyrus denté de souris adulte sous un stéréomicroscope a été démontrée dans ce protocole d'enregistrements vidéo.
Abstract
L'hippocampe est l'une des zones les plus étudiées dans le cerveau en raison de son rôle fonctionnel important dans le traitement de la mémoire et l'apprentissage, sa remarquable plasticité des cellules neuronales, et son implication dans l'épilepsie, les maladies neurodégénératives et les troubles psychiatriques. L'hippocampe est composé de régions distinctes; le gyrus denté, qui comprend principalement les neurones granulaires, et la corne d'Ammon, qui comprend principalement des neurones pyramidaux, et les deux régions sont reliées par deux circuits anatomiques et fonctionnelles. Beaucoup de différents ARNm et des protéines sont exprimées sélectivement dans le gyrus denté, et le gyrus denté est un site de la neurogenèse adulte, c'est de nouveaux neurones sont continuellement générés dans le gyrus denté pour adultes. Afin d'étudier l'expression des ARNm et des protéines spécifiques pour le gyrus denté, microdissection laser est souvent utilisé. Cette méthode a toutefois quelques limitations, comme la nécessité d'appareils spéciaux et des procédures de manipulation compliquée. Dans ce protocole d'enregistrements vidéo, nous démontrons une technique de dissection pour enlever le gyrus denté de souris adulte sous un stéréomicroscope. Échantillons gyrus denté préparés en utilisant cette technique sont adaptés à toute épreuve, y compris la transcriptomique, la protéomique, et les analyses de biologie cellulaire. Nous avons confirmé que le tissu est disséqué gyrus denté en effectuant des PCR en temps réel du gyrus denté de gènes spécifiques, le tryptophane 2,3-dioxygénase (TDO2) et desmoplakine (DSP), et d'Ammon Corne gènes enrichis, 1b du gène Meis-connexes (Mrg1b ) et TYRO3 protéine tyrosine kinase 3 (Tyro3). Les expressions des ARNm TDO2 et DSP dans les échantillons gyrus denté ont été détectés à des niveaux plus élevés de toute évidence, alors que Mrg1b et Tyro3 ont des niveaux plus bas que ceux dans les échantillons de la corne d'Ammon. Afin de démontrer l'avantage de cette méthode, nous avons effectué une analyse des microréseaux d'ADN en utilisant des échantillons de l'hippocampe et le gyrus denté entière. L'expression de l'ARNm du TDO2 et DSP, qui sont exprimés de manière sélective dans le gyrus denté, dans l'hippocampe ensemble de l'alpha-CaMKII + / - souris, exposées 0,037 et 0,10 fois les changements par rapport à celle des souris de type sauvage, respectivement. Dans le gyrus denté isolée, cependant, ces expressions exposées 0,011 et 0,021 fois changements par rapport à celle des souris de type sauvage, ce qui démontre que les changements d'expression génique dans le gyrus denté peuvent être détectés avec une plus grande sensibilité. Pris ensemble, cette technique de dissection pratique et précis peut être utilisé de manière fiable pour des études axées sur le gyrus denté.
Protocol
Dissection de gyrus denté hippocampique
- Dans une souris profondément anesthésiés, soigneusement disséquer le cerveau hors du crâne et de le placer dans la glace froide tampon phosphate salin (PBS).
- Dans une boîte de Petri contenant PBS glacé, coupé le cerveau le long de la fissure longitudinale du cerveau à l'aide d'un couteau chirurgical, et de couper les régions postérieures à lambda (mésencéphale, le rhombencéphale et le cervelet).
- Placez le côté médial hémisphère cérébral et, en utilisant une pince, retirer délicatement le diencéphale (thalamus et l'hypothalamus) sous un microscope de dissection. Cela permettra d'exposer la face médiale de l'hippocampe, permettant la visualisation du gyrus denté. Le gyrus denté se distingue de la corne d'Ammon par les écarts entre eux. Blessure à l'hippocampe ou dans les environs, il sera plus difficile d'isoler le gyrus denté.
- Insérez une forte aiguille à pointe (par exemple, de calibre 27-aiguille) dans chaque côté du gyrus denté (limites du gyrus denté et la corne d'Ammon; figure 1), et faites glisser les aiguilles superficiellement le long de l'axe septo-temporelle de l'hippocampe à isoler le gyrus denté.
- Ramassez le gyrus denté isolés à l'aide d'une aiguille ou une pince et le placer dans un tube d'échantillon. Les échantillons ainsi obtenus denté tissus gyrus peut être utilisé immédiatement pour toute analyse ou stockés dans un congélateur pour une utilisation ultérieure.
- Isoler le gyrus denté de l'autre hémisphère cérébral en utilisant la même méthode.
Quantitative PCR en temps réel
Le gyrus denté a été isolé en utilisant la méthode ci-dessus et l'hippocampe reste a été disséqué comme échantillon de corne d'Ammon de souris de type sauvage. PCR en temps réel de la bêta-actine, TDO2, DSP, Mrg1b et Tyro3 ont été effectuées avec le gyrus denté et des échantillons de la corne d'Ammon, comme décrit précédemment 1. Amorces 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG et 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC ont été utilisés pour Mrg1b et GCCTCCAAATTGCCCGTCA et 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA pour Tyro3.
L'analyse des microréseaux
Expériences biopuces ont été effectués avec des hommes souris de type sauvage et les souris hétérozygotes pour l'alpha-isoforme de calcium / calmoduline-dépendante protéine kinase II (alpha-CaMKII + / - souris), comme décrit précédemment 1. En bref, l'ARN isolé de l'hippocampe tout ou gyrus denté de souris de type sauvage et mutant a été hybridée avec une matrice de souris Génome 430 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA), et chaque GeneChip a été scannée par un scanner Affymetrix GeneChip 3000 (GCS3000) . L'analyse a été réalisée avec GeneChip Microarray Analysis Suite version 5.0.
Discussion
Le gyrus denté occupe environ 25% à 30% du volume de la formation hippocampique 2,3. Il a une composition cellulaire unique et joue un rôle crucial dans les fonctions cérébrales différentes. Par conséquent, des techniques pour isoler le gyrus denté sont utiles pour analyser les événements qui se produisent précisément dans cette région.
Ici, nous avons démontré une procédure efficace disséquer le gyrus denté de l'hippocampe de souris adultes et confirmé la précision de la technique. Premièrement, l'étude histologique a révélé que le gyrus denté a été séparé sans contamination par d'autres régions (figure 1), indiquant que d'un échantillon gyrus denté pur peut être préparé.
Deuxièmement, nous avons confirmé que le tissu est disséqué gyrus denté en effectuant des PCR en temps réel du gyrus denté de gènes spécifiques, TDO2 et DSP, et Ammon Corne gènes enrichis, et Mrg1b Tyro3 4 (figure 2). Les expressions d'ARNm de TDO2 (p = 0,000023; N = 4 et 4, respectivement) et DSP (p = 0,0000030; N = 4 et 4, respectivement) dans les échantillons gyrus denté ont été détectés à des niveaux bien évidemment plus élevé, alors que Mrg1b (p = 0.000080; N = 4 et 4, respectivement) et Tyro3 (p = 0,00017; N = 4 et 4, respectivement) ont été des niveaux inférieurs, à ceux dans les échantillons de la corne d'Ammon. Les niveaux d'expression de bêta-actine ne diffère pas dans ces échantillons (p = 0,11; N = 4 et 4, respectivement). Ainsi, nous pourrions vérifier si oui ou non le gyrus denté a été précisément disséqué par conducteur tel temps réel simple expériences de PCR.
Troisièmement, afin d'évaluer l'utilité de cette méthode de dissection, nous avons comparé le niveau d'expression d'ARNm de l'hippocampe entier avec celle du gyrus denté. Hippocampe entier et gyrus denté obtenu à partir du type sauvage (N = 9 et 4, respectivement) et l'alpha-CaMKII + / - souris (= N 18 et 4, respectivement) ont été traitées pour l'analyse des microréseaux, et pour tous les gènes marqués, le double changement a été calculée en divisant la valeur mutant par la valeur de type sauvage. Les résultats indiquent que les changements dans l'expression des ARNm, en particulier du gyrus denté molécules spécifiques tels que DSP et TDO2, ont été détectés jusqu'à une multiplication par 5 de la sensibilité dans les échantillons gyrus denté par rapport à l'ensemble des échantillons hippocampique (tableau 1). Nous avons précédemment démontré que l'alpha-CaMKII + / - souris présentent des comportements humains liés à des troubles psychiatriques tels que troubles de la mémoire de travail et un rythme exagérée infradien 1,5. Par ailleurs, les caractéristiques morphologiques et électrophysiologiques des neurones dans le gyrus denté des souris mutantes sont étonnamment semblables à celles des neurones immatures gyrus denté chez les rongeurs normaux, indiquant que les neurones dans ces souris mutantes ne parviennent pas à se développer jusqu'à maturité 1. Les immatures l'expression denté gyrus et régulé à la baisse de la DSP et TDO2 ARNm dans l'alpha-CaMKII + / - souris sont compatibles avec la conclusion selon laquelle DSP et TDO2 peuvent être utilisés comme marqueurs de cellules granulaires matures dans le gyrus denté (Ohira et al, non publié. données).
Pris ensemble, cette technique de dissection pratique et précis peut être utilisé de manière fiable pour des études axées sur le gyrus denté. Tissus gyrus denté obtenus en utilisant cette méthode est applicable à d'autres types d'analyses aussi bien, y compris les analyses de biologie cellulaire et en protéomique.
Figure 1. Vérification du gyrus denté isolée par l'étude histologique. Une coupe coronale du cerveau après avoir isolé gyrus denté a été traitée pour la coloration de Nissl (panneau de gauche), et un schéma adapté à partir du cerveau de souris représente la atlas6 approximativement le même niveau de la section représentée dans le panneau de gauche (panneau de droite). Les flèches indiquent les directions de l'insertion de l'aiguille à pointe. La barre d'échelle, de 1 mm.
Figure 2. Vérification du gyrus denté isolés par PCR en temps réel. Le gyrus denté et de la corne d'Ammon s obtenus à partir de quatre souris de type sauvage ont été traitées pour PCR en temps réel de la bêta-actine, TDO2, DSP, Mrg1b et Tyro3. Les résultats sont présentés en moyenne ± SEM. Pour l'analyse statistique, le test de Student t s a été employé, et les valeurs de p sont suivis: la bêta-actine, p = 0,11; TDO2, p = 0,000023 (** 1); Dsp, p = 0,0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3); Tyro3, p = 0,00017 (** 4).
Tableau 1. . Analyse des microréseaux de l'hippocampe et le gyrus denté ensemble des gènes exprimés différentiellement dans le gyrus dentelé et l'hippocampe ensemble de l'alpha-CaMKII + / - souris ont été déterminés en calculant le pli de changement de celle détectée dans les souris de type sauvage. Les données ont été analysées pour la signification statistique en utilisant le test t de Student s entre type sauvage et l'alpha-CaMKII + / - souris. Parmi les gènes dont l'expression exposées p <0,05 dans lesle gyrus denté de l'alpha-CaMKII + / - souris par rapport à celle des souris de type sauvage, les 50 premiers gènes sont répertoriés. Notez que le nombre d'échantillons pour gyrus denté sont beaucoup moins que ceux pour l'ensemble hippocampe. AffyID, Affymetrix sonde identifiant; CKII, l'alpha-CaMKII + / - souris; WT, souris de type sauvage.
| Denté gyrus (p <0,05) WT: n = 4, CKII + / -: n = 4 | Hippocampe entier WT: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| Titre Gene | Genebank | AffyID | Pliez le changement | valeur p | Pliez le changement | valeur p | ||
| desmoplakine | AV297961 | 1435494_s_at | 0,011018913 | 7.02694E-06 | 0,037021003 | 1.86126E-13 | ||
| desmoplakine | AV297961 | 1435493_at | 0,014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| tryptophane 2,3-dioxygénase | AI098840 | 1419093_at | 0,020986484 | 5.23546E-09 | 0,101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0,075479901 | 1.05191E-08 | 0,234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0,079457767 | 1.40433E-07 | 0,177974715 | 3.9758E-12 | ||
| thyrotropine libérant des récepteurs hormonaux | M59811 | 1449571_at | 0,103105815 | 0,003093796 | 0,801412732 | 0,283994361 | ||
| ryanodine récepteurs 1, le muscle squelettique | X83932 | 1427306_at | 0,104825517 | 3.38513E-07 | 0,650685017 | 0,000308462 | ||
| ignorant hélice boucle hélice 1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4,078815314 | 5.27E-11 | ||
| COPINE membre de la famille IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1,797304153 | 0,000296375 | ||
| doublecortine-like kinase 3 | BB326709 | 1436532_at | 0,109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| calpaïne 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0,111269769 | 8.07053E-06 | 0,370956608 | 2.04421E-14 | ||
| Adulte striatum hommes corpus d'ADNc, RIKEN pleine longueur enrichi la bibliothèque, clone: C030023B07 produit: inclassable, pleine séquence de l'insert | BB357628 | 1460043_at | 0,118712341 | 6.16926E-07 | 0,682339204 | 2.33001E-06 | ||
| collagène et la fixation du calcium FEM domaines 1 | AV264768 | 1437385_at | 0,124043978 | 3.65669E-05 | 0,488394112 | 4.05538E-06 | ||
| bêta-amyloïde (A4) précurseur de liaison aux protéines, la famille A, membre 2 de liaison aux protéines | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2,099164713 | 1.67047E-06 | ||
| calbindine 28K | BB177770 | 1456934_at | 0,130255444 | 3.32186E-06 | 0,572605751 | 1.99157E-10 | ||
| Le locus transcrit | AV328597 | 1443322_at | 0,133290835 | 5.43583E-06 | 0,562767164 | 7.56544E-06 | ||
| neuropeptide Y Y2 récepteurs | NM_008731 | 1417489_at | 0,135319609 | 0,000113407 | 0,781498474 | 0.00394504 | ||
| protéine Ras responsive element binding 1 | BE197381 | 1428657_at | 0,138235114 | 7.93691E-07 | 0,651220705 | 2.94209E-05 | ||
| la ligne neurotrophique dérivé des cellules gliales famille des récepteurs des facteurs alpha 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0,139062563 | 2.35371E-06 | 0,669544709 | 0,000214146 | ||
| préproenképhaline 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1,766018828 | 0,000250501 | ||
| RIKEN gène ADNc 1810010H24 | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| ryanodine récepteurs 1, le muscle squelettique | BG793713 | 1457347_at | 0,151364292 | 3.35612E-05 | 0,503144617 | 4.32907E-05 | ||
| protocadhérine 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0,152671849 | 8.57783E-06 | 0,670714726 | 1.56309E-05 | ||
| homologue cornichon 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0,153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | 0,661055608 | ||
| harakiri, BCL2 protéines en interaction (ne contient que BH3 domaine) | BQ175572 | 1439854_at | 0,154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| glucides (N-acétyl 4-0) sulfotransférase 9 | AK017407 | 1431897_at | 0,155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | 0,215637733 | ||
| calpaïne 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0,160871988 | 1.07655E-05 | 0,477164757 | 1.33753E-11 | ||
| doigt de zinc, de domaine contenant 5 CCHC | BQ126004 | 1437355_at | 0,161812078 | 3.08262E-06 | 0,421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrine | NM_008508 | 1448745_s_at | 0,165129967 | 1.86362E-05 | 0,639733409 | 0,000729772 | ||
| spondine 1, (f-spondine) des protéines de la matrice extracellulaire | BC020531 | 1451342_at | 0,168035879 | 6.67867E-07 | 0,821042412 | 0,023650765 | ||
| RIKEN ADNc du gène A930035E12 | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1,470383201 | 0,104085454 | ||
| BB247294 RIKEN pleine longueur enrichi, 7 jours cervelet nouveau-né Mus musculus clone d'ADNc A730018G18 3 ', la séquence d'ARNm. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1,968147585 | 0.00010636 | ||
| Domaine FERM contenant 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0,000345581 | 2,780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2,652516957 | 0,000206279 | |||
| Séquences transcrites | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1,296248831 | 0.22870031 | ||
| spondine 1, (f-spondine) des protéines de la matrice extracellulaire | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | 0,836181248 | 0,001380141 | ||
| calbindine 28K | BB246032 | 1448738_at | 0,180317904 | 1.35961E-05 | 0,647334052 | 4.12268E-09 | ||
| MARCKS-like 1 | AV110584 | 1437226_x_at | 0,186235935 | 1.47067E-06 | 0,499291387 | 2.34984E-08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0,187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0,282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0,188195795 | 0,000105295 | 0,915528892 | 0.35282097 | ||
| spondine 1, (f-spondine) des protéines de la matrice extracellulaire | BQ175871 | 1442613_at | 0,189956563 | 9.41195E-06 | 0,861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestine 3, la rétine | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3,944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN ADNc du gène A330050F15 | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0,000119342 | 0,660282035 | 2.47342E-05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0,194404608 | 4.08641E-07 | 0,918742591 | 0,022545297 | ||
| calbindine 28K | BB246032 | 1417504_at | 0,196381321 | 2.24182E-05 | 0,619305124 | 3.6222E-06 | ||
| libération de la gastrine peptide | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2,752845903 | 5.72954E-07 | ||
| Sortiline liés de domaine contenant des récepteurs VPS10 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | 0,029733649 | ||
| récepteur de la dopamine D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1,815881979 | 0,000516498 | ||
| proprotéine convertase subtilisine / Kexin type 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0,210528027 | 7.83039E-05 | 0,574126078 | 9.15496E-05 | ||
| récepteurs d'interleukine 1, de type I | NM_008362 | 1448950_at | 0,210572243 | 9.64524E-06 | 0,241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
Les expérimentations animales ont été effectuées en conformité avec l'Institut National de Guide de santé pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire, et approuvé par le comité de soins des animaux et l'utilisation à Fujita universitaire de santé.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Yoko Nabeshima l'Université de Kyoto pour son instruction sur la technique de dissection et Mme Aki Miyakawa au Fujita University Health pour son soutien au cinéma. Ce travail a été soutenu par le Programme pour la promotion des recherches fondamentales en sciences de la santé de l'Institut national de l'innovation biomédicale, une subvention en aide pour la recherche scientifique sur les priorités de recherche dans le cerveau les zones-intégrative (Shien) - à partir du MEXT au Japon, et par une subvention en aide à partir crête de la Japan Science and Technology Agency.
References
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