Summary
Una tecnica di dissezione per la rimozione del giro dentato da topo adulto allo stereomicroscopio è stata dimostrata in questo video-registrato di protocollo.
Abstract
L'ippocampo è una delle zone più studiati nel cervello a causa del suo importante ruolo funzionale nella elaborazione della memoria e l'apprendimento, la sua notevole plasticità delle cellule neuronali, e il suo coinvolgimento in epilessia, malattie neurodegenerative, e disturbi psichiatrici. L'ippocampo è composto da diverse regioni, il giro dentato, che comprende principalmente i neuroni dei granuli, e corno di Ammon, che comprende principalmente i neuroni piramidali, e le due regioni sono collegate da entrambi i circuiti anatomici e funzionali. Molti mRNA differenti e le proteine sono selettivamente espresse nel giro dentato, e il giro dentato è un sito di neurogenesi adulta, cioè nuovi neuroni sono continuamente generati nel giro dentato adulti. Per studiare l'espressione di mRNA e proteine specifiche per il giro dentato, microdissezione laser capture viene spesso utilizzata. Questo metodo ha alcune limitazioni, tuttavia, come la necessità di apparecchiature particolari e complicate procedure di gestione. In questo video-registrato protocollo, abbiamo dimostrato una tecnica di dissezione per la rimozione del giro dentato da topo adulto sotto uno stereomicroscopio. Campioni giro dentato preparato con questa tecnica sono adatte ad ogni test, tra cui trascrittomica, proteomica e analisi di biologia delle cellule. Abbiamo confermato che il tessuto è sezionato giro dentato conducendo PCR in tempo reale di giro dentato geni specifici, triptofano 2,3-diossigenasi (TDO2) e desmoplakina (Dsp), e Ammon corno geni arricchito, Meis legati 1b gene (Mrg1b ) e TYRO3 proteina tirosin-chinasi 3 (Tyro3). Le espressioni di mRNA TDO2 e Dsp nei campioni giro dentato Sono state rinvenute, ovviamente, più elevati, mentre Mrg1b e Tyro3 erano più bassi livelli, rispetto a quelle dei campioni del corno di Ammone. Per dimostrare il vantaggio di questo metodo, abbiamo effettuato delle analisi del DNA microarray utilizzando campioni di ippocampo intero e giro dentato. L'espressione di mRNA TDO2 e DSP, che sono espressi selettivamente nel giro dentato, nell'ippocampo tutto di alfa-CaMKII + / - topi esposti 0,037 e 0,10 volte i cambiamenti rispetto a quella di topi wild-type, rispettivamente. Nel giro dentato isolato, però, queste espressioni esposti 0,011 e 0,021 volte modifiche rispetto a quella di topi wild-type, dimostrando che i cambiamenti dell'espressione genica in giro dentato possono essere rilevati con maggiore sensibilità. Nel loro insieme, questa tecnica dissezione comodo e preciso in modo attendibile utilizzato per studi si sono concentrati sul giro dentato.
Protocol
Dissezione di giro dentato dell'ippocampo
- In un mouse profondamente anestetizzati, accuratamente sezionare il cervello fuori dal cranio e il luogo in ghiacciata tampone fosfato salino (PBS).
- In una capsula di Petri contenente ghiaccio PBS freddo, tagliare il cervello lungo la fessura longitudinale del cervello utilizzando un bisturi, e tagliare le regioni posteriori a lambda (mesencefalo, romboencefalo, e cervelletto).
- Posizionare il lato mediale dell'emisfero cerebrale e, con cautela il numero del diencefalo (talamo e ipotalamo) al microscopio di dissezione. Questo esporre il lato mediale dell'ippocampo, consentendo la visualizzazione del giro dentato. Il giro dentato è distinguibile dal corno di Ammone da parte del gap tra di loro. Lesioni all'ippocampo o nell'area circostante renderà più difficile isolare il giro dentato.
- Inserire un forte ago-punta (ad esempio, 27-gauge) in ogni lato del giro dentato (confini del giro dentato e corno di Ammon; Figura 1), e far scorrere gli aghi superficialmente lungo il setto-temporale asse di ippocampo di isolare il giro dentato.
- Sollevare il giro dentato isolato usando un ago o pinze e collocarlo in una provetta. Il così-dentato ottenuto campione di tessuto giro può essere utilizzato immediatamente per qualsiasi saggio o conservati in un congelatore per un uso successivo.
- Isolare il giro dentato dall'altro emisfero cerebrale utilizzando lo stesso metodo.
Quantitativa real-time PCR
Il giro dentato è stato isolato utilizzando il metodo sopra menzionato e l'ippocampo rimanente è stato sezionato come esempio il corno di Ammone da topi wild-type. PCR in tempo reale di beta-actina, TDO2, DSP, Mrg1b e Tyro3 sono stati eseguiti con il giro dentato e campioni di corno di Ammon come descritto in precedenza 1. Primer 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG e 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC sono stati utilizzati per Mrg1b e GCCTCCAAATTGCCCGTCA e 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA per Tyro3.
Microarray analisi
Esperimenti di microarray sono stati effettuati con maschi topi wild-type e topi eterozigoti per l'alfa-isoforma di calcio / calmodulina-dipendente delle proteine chinasi II (alpha-CaMKII + / - topi) come descritto in precedenza 1. In breve, l'RNA isolato da tutto l'ippocampo o giro dentato di topi wild-type e mutante è stato ibridato con un mouse Genome Array 430 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA), e ogni GeneChip è stato analizzato da un Affymetrix GeneChip scanner 3000 (GCS3000) . GeneChip analisi è stata eseguita con Microarray Analysis Suite versione 5.0.
Discussion
Il giro dentato occupa circa il 25% al 30% del volume della formazione dell'ippocampo 2,3. Ha una composizione unica delle cellule e svolge un ruolo fondamentale nelle funzioni cerebrali diverse. Pertanto, le tecniche per isolare il giro dentato sono utili per analizzare gli eventi che si verificano in particolare in questa regione.
Qui, abbiamo dimostrato una procedura per sezionare in modo efficiente il giro dentato dell'ippocampo di topo adulto e ha confermato la precisione della tecnica. In primo luogo, lo studio istologico ha rivelato che il giro dentato era separato senza contaminazione da altre regioni (Figura 1), che indica che un campione puro giro dentato possono essere preparati.
In secondo luogo, abbiamo confermato che il tessuto è sezionato giro dentato conducendo real-time PCR del giro dentato geni specifici, TDO2 e DSP, e corno di Ammon geni arricchito, Mrg1b e Tyro3 4 (Figura 2). Le espressioni mRNA di TDO2 (p = 0,000023; n E = 4 e 4, rispettivamente) e DSP (p = 0,0000030, n E = 4 e 4, rispettivamente) nei campioni giro dentato Sono state rinvenute, ovviamente, più elevati, mentre Mrg1b (p = 0.000080, n E = 4 e 4, rispettivamente) e Tyro3 (p = 0,00017, n E = 4 e 4, rispettivamente) sono stati più bassi, rispetto a quelli nei campioni corno di Ammon. Beta-actina livelli di espressione non differivano in questi campioni (p = 0,11, n E = 4 e 4, rispettivamente). Così, abbiamo potuto verificare se il giro dentato è stato accuratamente sezionato da condurre tale semplici esperimenti in tempo reale PCR.
In terzo luogo, per valutare l'utilità di questo metodo di dissezione, abbiamo confrontato il livello di espressione di mRNA di ippocampo tutto con quella del giro dentato. Ippocampo intero e giro dentato ottenuto da wild-type (n = 9 e 4, rispettivamente) e alfa-CaMKII + / - topi (n è = 18 e 4, rispettivamente) sono stati processati per l'analisi microarray, e per tutti i geni segnato, la piega- cambiamento è stato calcolato dividendo il valore mutante dalla wild-type di valore. I risultati hanno indicato che i cambiamenti di espressione dell'mRNA, in particolare di giro dentato specifiche molecole come DSP e TDO2, sono stati rilevati fino ad un aumento di 5 volte nella sensibilità nei campioni giro dentato rispetto ai campioni di tutto dell'ippocampo (Tabella 1). Abbiamo precedentemente dimostrato che l'alfa-CaMKII + / - topi mostrano comportamenti relativi alla umano disturbi psichiatrici come deficit di memoria di lavoro e un ritmo esagerato infradiani 1,5. Inoltre, le caratteristiche morfologiche ed elettrofisiologiche dei neuroni nel giro dentato topi mutanti sono sorprendentemente simili a quelle di neuroni immaturi giro dentato nei roditori normali, indicando che i neuroni di questi topi mutanti non riescono a svilupparsi fino alla scadenza 1. L'immaturo espressione dentato giro e down-regolato di Dsp e TDO2 mRNA in alpha-CaMKII + / - i topi sono in linea con la constatazione che Dsp e TDO2 possono essere utilizzati come marcatori delle cellule dei granuli maturi nel giro dentato (Ohira et al, non pubblicata. dati).
Nel loro insieme, questa tecnica dissezione comodo e preciso in modo attendibile utilizzato per studi si sono concentrati sul giro dentato. Tessuto giro dentato ottenuto con questo metodo è applicabile ad altri tipi di analisi pure, comprese le analisi proteomica e di biologia cellulare.
Figura 1. Verifica del giro dentato isolati dallo studio istologico. Una sezione coronale del cervello dopo aver isolato giro dentato è stato elaborato per la colorazione di Nissl (riquadro a sinistra), e un diagramma schematico tratto dal cervello di topo atlas6 rappresenta circa lo stesso livello della sezione mostrata nel pannello di sinistra (pannello di destra). Le frecce indicano le direzioni dell'ago punta di inserimento. Scala grafica, 1 mm.
Figura 2. Verifica del giro dentato isolata dal real-time PCR. Il giro dentato e il corno di Ammone s ottenuto da quattro topi wild-type sono stati trattati per PCR in tempo reale di beta-actina, TDO2, DSP, Mrg1b e Tyro3. I risultati sono presentati come media ± SEM. Per l'analisi statistica, test t di Student s è stato impiegato, e valori di p sono seguiti: beta-actina, p = 0,11; TDO2, p = 0,000023 (** 1); Dsp, p = 0,0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3), e Tyro3, p = 0,00017 (** 4).
Tabella 1. . Analisi microarray di dell'ippocampo tutto e giro dentato geni differenzialmente espressi nel giro dentato dell'ippocampo e tutta l'alpha-CaMKII + / - i topi sono stati determinati calcolando il fold-change da quello rilevato in topi wild-type. I dati sono stati analizzati per la significatività statistica utilizzando il test t di Student s tra wild-type e alfa-CaMKII + / - topi. Tra i geni la cui espressione esposti p <0,05 inil giro dentato di alpha-CaMKII + / - topi rispetto a quella di topi wild-type, i primi 50 geni sono elencati. Si noti che il numero di campioni per giro dentato sono molto meno di quelli per intero ippocampo. AffyID, Affymetrix sonda identificatore; CKII, alpha-CaMKII + / - topi; WT, topi wild-type.
| Giro dentato (p <0,05) WT: n = 4, CKII + / -: n = 4 | Ippocampo tutto WT: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| Gene Titolo | Alle banche di geni | AffyID | Fold change | valore di p | Fold change | valore di p | ||
| desmoplakina | AV297961 | 1435494_s_at | 0,011018913 | 7.02694E-06 | 0,037021003 | 1.86126E-13 | ||
| desmoplakina | AV297961 | 1435493_at | 0,014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| triptofano 2,3-diossigenasi | AI098840 | 1419093_at | 0,020986484 | 5.23546E-09 | 0,101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0,075479901 | 1.05191E-08 | 0,234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0,079457767 | 1.40433E-07 | 0,177974715 | 3.9758E-12 | ||
| tireotropina rilasciando recettore ormonale | M59811 | 1449571_at | 0,103105815 | 0,003093796 | 0,801412732 | 0,283994361 | ||
| recettore della rianodina 1, del muscolo scheletrico | X83932 | 1427306_at | 0,104825517 | 3.38513E-07 | 0,650685017 | 0,000308462 | ||
| ignorante anello elica elica 1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4,078815314 | 5.27E-11 | ||
| copine familiare IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1,797304153 | 0,000296375 | ||
| doublecortin-like chinasi 3 | BB326709 | 1436532_at | 0,109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| calpaina 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0,111269769 | 8.07053E-06 | 0,370956608 | 2.04421E-14 | ||
| Adulti di sesso maschile corpo striato cDNA, RIKEN full-length arricchito biblioteca, clone: C030023B07 prodotto: inclassificabile, inserire la sequenza completa | BB357628 | 1460043_at | 0,118712341 | 6.16926E-07 | 0,682339204 | 2.33001E-06 | ||
| collagene e calcio vincolante FEG settori 1 | AV264768 | 1437385_at | 0,124043978 | 3.65669E-05 | 0,488394112 | 4.05538E-06 | ||
| precursore della proteina beta amiloide vincolante, la famiglia A, membro 2 legame con le proteine (A4) | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2,099164713 | 1.67047E-06 | ||
| calbindin-28K | BB177770 | 1456934_at | 0,130255444 | 3.32186E-06 | 0,572605751 | 1.99157E-10 | ||
| Locus trascritto | AV328597 | 1443322_at | 0,133290835 | 5.43583E-06 | 0,562767164 | 7.56544E-06 | ||
| neuropeptide Y recettori Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0,135319609 | 0,000113407 | 0,781498474 | 0.00394504 | ||
| ras proteine elemento reattivo legame 1 | BE197381 | 1428657_at | 0,138235114 | 7.93691E-07 | 0,651220705 | 2.94209E-05 | ||
| linea cellulare gliale neurotrofico derivato della famiglia dei recettori fattore alpha 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0,139062563 | 2.35371E-06 | 0,669544709 | 0,000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1,766018828 | 0,000250501 | ||
| RIKEN gene cDNA 1810010H24 | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| recettore della rianodina 1, del muscolo scheletrico | BG793713 | 1457347_at | 0,151364292 | 3.35612E-05 | 0,503144617 | 4.32907E-05 | ||
| Protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0,152671849 | 8.57783E-06 | 0,670714726 | 1.56309E-05 | ||
| cornichon omologo 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0,153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | 0,661055608 | ||
| harakiri, BCL2 proteine interagenti (contiene solo BH3 dominio) | BQ175572 | 1439854_at | 0,154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| carboidrati (N-acetilgalattosamina 4-0) sulfotransferasi 9 | AK017407 | 1431897_at | 0,155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | 0,215637733 | ||
| calpaina 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0,160871988 | 1.07655E-05 | 0,477164757 | 1.33753E-11 | ||
| dito di zinco, dominio CCHC contenente 5 | BQ126004 | 1437355_at | 0,161812078 | 3.08262E-06 | 0,421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0,165129967 | 1.86362E-05 | 0,639733409 | 0,000729772 | ||
| spondina 1, (f-spondina) di proteine della matrice extracellulare | BC020531 | 1451342_at | 0,168035879 | 6.67867E-07 | 0,821042412 | 0,023650765 | ||
| RIKEN cDNA A930035E12 gene | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1,470383201 | 0,104085454 | ||
| BB247294 RIKEN full-length arricchito, 7 giorni neonato Mus musculus cervelletto clone cDNA A730018G18 3 ', sequenza di mRNA. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1,968147585 | 0.00010636 | ||
| Dominio FERM contenente 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0,000345581 | 2,780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2,652516957 | 0,000206279 | |||
| Sequenze trascritte | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1,296248831 | 0.22870031 | ||
| spondina 1, (f-spondina) di proteine della matrice extracellulare | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | 0,836181248 | 0,001380141 | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1448738_at | 0,180317904 | 1.35961E-05 | 0,647334052 | 4.12268E-09 | ||
| Marcks-come 1 | AV110584 | 1437226_x_at | 0,186235935 | 1.47067E-06 | 0,499291387 | 2.34984E-08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0,187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0,282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0,188195795 | 0,000105295 | 0,915528892 | 0.35282097 | ||
| spondina 1, (f-spondina) di proteine della matrice extracellulare | BQ175871 | 1442613_at | 0,189956563 | 9.41195E-06 | 0,861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestina 3, della retina | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3,944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN cDNA A330050F15 gene | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0,000119342 | 0,660282035 | 2.47342E-05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0,194404608 | 4.08641E-07 | 0,918742591 | 0,022545297 | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1417504_at | 0,196381321 | 2.24182E-05 | 0,619305124 | 3.6222E-06 | ||
| gastrina rilasciando peptide | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2,752845903 | 5.72954E-07 | ||
| sortilin legati VPS10 dominio contenente recettore 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | 0,029733649 | ||
| recettore della dopamina D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1,815881979 | 0,000516498 | ||
| proprotein convertasi subtilisina / kexin tipo 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0,210528027 | 7.83039E-05 | 0,574126078 | 9.15496E-05 | ||
| interleuchina 1 recettore di tipo I | NM_008362 | 1448950_at | 0,210572243 | 9.64524E-06 | 0,241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
Gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institute of Health Guide di cura e dell'uso degli animali da laboratorio, e approvato dal comitato di cura degli animali e l'uso di Fujita University Health.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Yoko Nabeshima dell'Università di Kyoto per il suo insegnamento sulla tecnica di dissezione e la signora Aki Miyakawa a Fujita University Health per il suo sostegno al cinema. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma per la promozione di studi fondamentali in Scienze della Salute dell 'Istituto Nazionale per l'Innovazione Biomedica, una sovvenzione in aiuti per la ricerca scientifica sulle Settori prioritari-Integrativa Brain Research (Shien) - da MEXT in Giappone, e da una borsa-in-Aid dal CREST di Scienze Giappone e Agenzia Technology.
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