Summary
stereomicroscope 이하 성인 마우스에서 이가있는 이랑의 제거를위한 해부 기술이 비디오 녹화 프로토콜에서 시연되었다.
Abstract
해마 때문에 메모리 처리와 학습의 중요한 기능 역할, 빼어난의 연결을 세포 소성, 그리고 간질에서의 참여, neurodegenerative 질병 및 정신 장애의 두뇌에서 가장 널리 연구 분야 중 하나입니다. 해마는 별개의 영역으로 구성되며 주로 과립 뉴런, 주로 피라미드 뉴런으로 구성되어 암몬의 경적, 그리고 두 영역으로 구성되어 이가있는 이랑이, 해부학 및 기능 회로 모두에 의해 연결되어 있습니다. 여러 mRNAs와 단백질이 선택적으로 이가있는 이랑에 표현하고, 이가있는 이랑 성인 neurogenesis의 사이트입니다되며 즉, 새로운 뉴런이 지속적으로 성인 이가있는 이랑에 생성됩니다. 이가있는 이랑에 특정 mRNA와 단백질 표현을 조사하기 위해, 레이저 캡처 microdissection가 자주 사용됩니다. 이 방법은 특별한 apparatuses 복잡한 처리 절차가 필요로하지만, 몇 가지 제약 사항들이있다. 이 비디오 녹화 프로토콜에서는, 우리는 stereomicroscope 미만 성인 마우스에서 이가있는 이랑을 제거하는 절개 기법을 보여줍니다. 이 기술을 사용하여 준비 이가있는 이랑 샘플 transcriptomic, proteomic, 그리고 세포 생물학 분석 포함한 모든 분석에 대한 적합합니다. 우리는 해부 조직은 실시간 이가있는 이랑 특정 유전자의 PCR, 트립토판 2,3 - dioxygenase (TDO2)와 desmoplakin (DSP), 그리고 암몬의 경적 농축 유전자, Meis 관련 유전자 1B (Mrg1b을 실시하여 이가있는 이랑 확인 )와 TYRO3 단백질 티로신 키나제의 3 (Tyro3). Mrg1b과 Tyro3은 암몬의 호른 샘플에서보다 낮은 수준되었다 반면 이가있는 이랑 샘플에 TDO2 및 DSP의 mRNA 표현은 분명히 더 높은 수준에서 발견되었습니다. 이 방법의 장점을 설명하기 위해, 우리는 전체 해마와 이가있는 이랑의 샘플을 사용하여 DNA microarray 분석을 수행했습니다. 알파 - CaMKII + /의 전체 해마에 이가있는 이랑에 선택적으로 표현 TDO2 및 DSP의 mRNA 표현 - 마우스는 각각 0.037과 야생 형 생쥐의에 비해 0.10 배 변화를 전시. 격리 이가있는 이랑 그러나, 이러한 표현보다 감성과 감지가 가능하다 이가있는 이랑에 유전자 발현의 변화를 보여주는 0.011과 야생 형 생쥐의에 비해 0.021 배 변화를 전시. 함께 촬영이 편리하고 정확한 해부 기술은 안정적으로 이가있는 이랑에 초점을 맞춘 연구에 사용될 수 있습니다.
Protocol
hippocampal 이가있는 이랑의 해부
- 깊은 anesthetized 마우스에서 조심스럽게 두개골의 두뇌를 해부하다 얼음처럼 차가운 인산 버퍼 호수 (PBS)에 넣습니다.
- 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 페트리 접시에, 수술 칼을 사용하여 뇌를의 종방향 균열 (fissure)을 따라 머리를 잘라, 그리고 람다에 후부의 영역을 (midbrain, hindbrain 및 소뇌) 잘라.
- 대뇌 반구 내측 측면을 놓고, 집게를 사용하여 신중하게 해부 현미경 아래 diencephalon을 (시상과 시상 하부)를 제거하십시오. 이것은 이가있는 이랑의 시각화에 대한 허용, 해마의 중간 측면을 폭로합니다. 이가있는 이랑 그들 사이의 차이에 의해 암몬의 호른에서 구별됩니다. 해마이나 주변 지역으로 부상은 더 어려워 이가있는 이랑을 분리하는 것입니다.
- 이가있는 이랑 (이가있는 이랑과 암몬의 호른 경계, 그림 1)의 각 측면에 날카로운 바늘 끝 (예, 27 게이지 바늘) 삽입 및 분리 해마의 셉토 - 시간적 축을 따라 표면적으로 바늘을 슬라이드 이가있는 이랑.
- 바늘이나 집게를 사용하여 격리 이가있는 이랑을 선택하고 샘플 튜브에 놓으십시오. 따라서 - 얻은 이가있는 이랑 조직 샘플은 어떤 분석을 위해 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 깊은 냉동실에 저장할 수 있습니다.
- 같은 방법을 사용하여 다른 대뇌 반구에서 이가있는 이랑을 분리.
정량 실시간 PCR
이가있는 이랑은 위에서 언급한 방법과 나머지 해마가 야생 형 생쥐에서 암몬의 호른 샘플로 밖으로 해부했다를 사용하여 격리되었다. 베타 굴지, TDO2, DSP, Mrg1b 및 Tyro3의 실시간 PCR은 이가있는 이랑과 이전 1에서 설명하는 것처럼 암몬의 나팔 소리 샘플과 함께 수행했다. Primers 5' - CTGGCGAGATCACGATGACG 및 5' - AAGCTACGCTGTTGTCTAACC은 Tyro3에 대한 Mrg1b, 그리고 GCCTCCAAATTGCCCGTCA 및 5' - CCAGCACTGGTACATGAGATCA 사용되었습니다.
Microarray 분석
(- 마우스 알파 - CaMKII + /)로 이전 1 설명한 Microarray 실험은 남성 야생 형 마우스 및 칼슘 / calmodulin에 의존 단백질 키나 아제 II의 알파 이소형에 대한 heterozygous 생쥐와 함께 수행했다. 간단히, 야생 타입과 돌연변이 생쥐의 전체 해마 또는 이가있는 이랑으로부터 격리 RNA는 마우스 게놈 430 2.0 배열 (Affymetrix, 산타 클라라, CA)를 hybridized되었고, 각 GeneChip은 Affymetrix GeneChip 스캐너 3000 (GCS3000)로 스캔했습니다 . GeneChip Microarray 분석은 분석 스위트 버전 5.0과 함께 수행했다.
Discussion
이가있는 이랑이 hippocampal 형성 2,3의 볼륨의 약 25 % 30 % 차지하고 있습니다. 그것은 독특한 세포 구성을 가지고 있으며 다양한 뇌 기능에 중요한 역할을 담당합니다. 따라서 이가있는 이랑을 분리하는 기술은이 지역에서 특히 발생하는 이벤트를 분석하는 데 유용합니다.
여기, 우리는 효율적으로 성인 마우스 해마에서 이가있는 이랑을 해부하다하는 절차를 시연하고 기술의 정밀도를 확인했습니다. 첫째, histologic 연구는 이가있는 이랑이 순수한 이가있는 이랑 샘플을 준비할 수 나타내는 다른 지역에 의해 오염 (그림 1)하지 않고 분리된 것으로 나타났다.
둘째, 우리는 해부 조직 이가있는 이랑 특정 유전자, TDO2 및 DSP, 그리고 암몬의 경적 농축 유전자, Mrg1b 및 Tyro3 4 (그림 2)의 실시간 PCR을 실시하여 이가있는 이랑되어있는 것으로 확인되었습니다. TDO2의 mRNA 표현 (P = 0.000023; N의 = 4, 4, 각각)와 DSP (P = 0.0000030; N의 각각 = 4 4) 이가있는 이랑 샘플의는 분명 높은 수준에서 발견되었습니다 반면 Mrg1b (P = 0.000080; N의 = 4, 4, 각각)와 Tyro3 (P = 0.00017; N의 각각 = 4 4) 암몬의 호른 샘플에서보다 낮은 수준되었습니다. (; N의 = 4, 4, 각각 P = 0.11) 베타 굴지의 표현 수준이 샘플에서는 다를하지 않았다. 따라서, 우리는 이가있는 이랑이 정확하게 같은 간단한 실시간 PCR 실험을 실시 의해 해부되었다 여부를 확인 수 있습니다.
이 절개 방법의 유용성을 평가하기 위해, 셋째, 우리는 이가있는 이랑의와 전체 해마의 mRNA 발현 수준을 비교했다. 생쥐 (각각 N의 = 18 4) microarray 분석을위한 처리했고, 모든 유전자 득점 들어, 접이식 - 야생 형 (N의 = 9, 4, 각각)와 알파 - CaMKII + /이 얻은 전체 해마와 이가있는 이랑 변경 사항은 야생 형 값에 의해 돌연변이 가치를 나누어 계산했습니다. 결과는 특히 DSP 및 TDO2 같은 이가있는 이랑 특정 분자의 mRNA 표현의 변화가, 전체 hippocampal 샘플 (표 1)에 비해 이가있는 이랑 샘플의 감도에 5 배 증가와 발견 있다고 지적했다. 쥐 전시 행동과 같은 작업 메모리 결손과 과장 infradian 리듬 1.5 인간 정신 장애에 관한 - 우리는 이전에 알파 - CaMKII + / 그 보여주었다. 또한 돌연변이 생쥐에있는 이가있는 이랑의 뉴런의 morphologic 및 electrophysiologic 기능은 이러한 돌연변이 생쥐의 뉴런은 만기 1 개발에 실패했음을 나타냅니다 정상적인 설치류에 미숙한 이가있는 이랑의 뉴런의 것과 놀랍도록 닮아있다. 미숙 이가있는 이랑 아래 - 규제 DSP의 표현과 알파 - CaMKII의 TDO2 mRNA는 + / - 생쥐는 DSP와 TDO2는 이가있는 이랑 (오히라 외의 성숙 과립 세포의 마커로 사용될 수있다는 발견과 일치 있으며, 게시되지 않은. 데이터).
함께 촬영이 편리하고 정확한 해부 기술은 안정적으로 이가있는 이랑에 초점을 맞춘 연구에 사용될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 얻은 이가있는 이랑 조직 및 세포 생물학 proteomic 분석을 포함한 분석뿐만 아니라 다른 유형의에 적용됩니다.
그림 1. histologic 연구에 의해 격리 이가있는 이랑을 확인한다. 이가있는 이랑을 분리 후 뇌의 코로나 섹션 Nissl 얼룩 (왼쪽 패널)의 처리, 그리고 마우스 뇌 atlas6에서 적응 도식 그림은 왼쪽 패널 (오른쪽 패널)에 표시된 섹션의 거의 동일한 수준을 나타냅니다했다. 화살표는 바늘 팁 삽입의 방향을 나타냅니다. 스케일 바, 1mm.
그림 2. 실시간 PCR에 의해 격리 이가있는 이랑을 확인한다. 네 야생 형 생쥐에서 얻은 이가있는 이랑과 암몬의 나팔 소리는 실시간으로 베타 - 굴지의 PCR, TDO2, DSP, Mrg1b 및 Tyro3에 대한 처리되었습니다. 결과는 ± SEM을 수단으로 제공됩니다. 통계 분석을 위해, 학생 S T 시험은 채용되었고, P 값은 다음과 같습니다 베타 굴지, P = 0.11; TDO2, P = 0.000023 (** 1), DSP, P = 0.0000030 (** 2) Mrg1b, P = 0.000080 (** 3), 그리고 Tyro3, P = 0.00017 (** 4).
표 1. . 전체 해마와 이가있는 이랑의 Microarray 분석 유전자 differentially 알파 - CaMKII의 이가있는 이랑과 전체 해마로 표현 + / - 생쥐는 야생 형 생쥐에서 발견되는의 접이식 변화를 계산하여 결정됩니다. 생쥐 - 데이터는 야생 유형 및 알파 - CaMKII + / 사이의 학생 S T 테스트를 사용하여 통계적 의의에 대한 분석했다. 유전자 중에는 그의 표현은 <0.05의 P를 전시알파 - CaMKII + /의 이가있는 이랑 - 야생 형 생쥐의 비교 생쥐는 상위 50 개 유전자가 나열되어 있습니다. 이가있는 이랑에 대한 샘플의 숫자가 훨씬 적은 전체 해마에 비해됩니다. AffyID, Affymetrix 프로브 식별자, CKII, 알파 - CaMKII + / - 생쥐, WT, 야생 형 생쥐.
| 이가있는 이랑 (P는 <0.05) WT : N = 4, CKII + / - : N = 4 | 전체 해마 WT : N = 9, CKII + / - : N = 18 | |||||||
| 유전자 제목 | Genebank | AffyID | 폴드 변경 | P 값 | 폴드 변경 | P 값 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | 0.011018913 | 7.02694E - 06 | 0.037021003 | 1.86126E - 13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0.014369734 | 7.86747E - 06 | 0.04232106 | 1.00579E - 12 | ||
| 트립토판 2,3 - dioxygenase | AI098840 | 1419093_at | 0.020986484 | 5.23546E - 09 | 0.101037776 | 4.14823E - 13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0.075479901 | 1.05191E - 08 | 0.234001154 | 1.66301E - 15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0.079457767 | 1.40433E - 07 | 0.177974715 | 3.9758E - 12 | ||
| thyrotropin이 호르몬 수용체를 발표 | M59811 | 1449571_at | 0.103105815 | 0.003093796 | 0.801412732 | 0.283994361 | ||
| ryanodine 수용체 1, 골격근 | X83932 | 1427306_at | 0.104825517 | 3.38513E - 07 | 0.650685017 | 0.000308462 | ||
| 무지한 나선형 루프 나선 일 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E - 06 | 4.078815314 | 5.27E - 11 | ||
| copine 가족 구성원 IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E - 06 | 1.797304153 | 0.000296375 | ||
| doublecortin 같은 키나제 3 | BB326709 | 1436532_at | 0.109336662 | 1.95278E - 07 | 0.56697229 | 2.62633E - 08 | ||
| calpain 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0.111269769 | 8.07053E - 06 | 0.370956608 | 2.04421E - 14 | ||
| 성인 남성 코퍼스의 striatum cDNA, RIKEN 전체 길이 풍부한 라이브러리, 클론 : C030023B07 제품 : unclassifiable 전체 삽입 순서 | BB357628 | 1460043_at | 0.118712341 | 6.16926E - 07 | 0.682339204 | 2.33001E - 06 | ||
| 콜라겐 및 칼슘 결합 EGF가 1 도메인 | AV264768 | 1437385_at | 0.124043978 | 3.65669E - 05 | 0.488394112 | 4.05538E - 06 | ||
| 아밀로이드 베타 (A4) 전구체 단백질 바인딩, 가족, 회원이 결합 단백질 | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E - 06 | 2.099164713 | 1.67047E - 06 | ||
| calbindin - 28K | BB177770 | 1456934_at | 0.130255444 | 3.32186E - 06 | 0.572605751 | 1.99157E - 10 | ||
| 베꼈는데 로커스 | AV328597 | 1443322_at | 0.133290835 | 5.43583E - 06 | 0.562767164 | 7.56544E - 06 | ||
| neuropeptide Y 수용체 Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0.135319609 | 0.000113407 | 0.781498474 | 0.00394504 | ||
| RAS 반응 요소 결합 단백질 1 | BE197381 | 1428657_at | 0.138235114 | 7.93691E - 07 | 0.651220705 | 2.94209E - 05 | ||
| glial 세포 라인 neurotrophic 요인 가족 수용체에게 알파 2 파생 | BB284482 | 1433716_x_at | 0.139062563 | 2.35371E - 06 | 0.669544709 | 0.000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E - 08 | 1.766018828 | 0.000250501 | ||
| RIKEN cDNA 유전자 1810010H24 | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E - 05 | 2.77573142 | 6.81865E - 09 | ||
| ryanodine 수용체 1, 골격근 | BG793713 | 1457347_at | 0.151364292 | 3.35612E - 05 | 0.503144617 | 4.32907E - 05 | ||
| protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0.152671849 | 8.57783E - 06 | 0.670714726 | 1.56309E - 05 | ||
| cornichon의 상동체 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0.153724144 | 8.90755E - 06 | 0.95780695 | 0.661055608 | ||
| harakiri, BCL2 상호 작용하는 단백질 (단 BH3 도메인을 포함) | BQ175572 | 1439854_at | 0.154284407 | 2.0118E - 05 | 0.56516812 | 4.86925E - 09 | ||
| 탄수화물 (N - acetylgalactosamine 4-0) sulfotransferase 9 | AK017407 | 1431897_at | 0.155238951 | 5.37423E - 06 | 1.14910007 | 0.215637733 | ||
| calpain 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0.160871988 | 1.07655E - 05 | 0.477164757 | 1.33753E - 11 | ||
| 아연 손가락, 5를 포함 CCHC 도메인 | BQ126004 | 1437355_at | 0.161812078 | 3.08262E - 06 | 0.421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0.165129967 | 1.86362E - 05 | 0.639733409 | 0.000729772 | ||
| spondin 1 (F - spondin) 세포외 기질 단백질 | BC020531 | 1451342_at | 0.168035879 | 6.67867E - 07 | 0.821042412 | 0.023650765 | ||
| RIKEN cDNA 유전자 A930035E12 | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E - 07 | 1.470383201 | 0.104085454 | ||
| BB247294 RIKEN 전체 길이 풍부한 7 일 neonate 소뇌 뮤스 musculus cDNA 클론 A730018G18 3 'mRNA 순서. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E - 05 | 1.968147585 | 0.00010636 | ||
| 잠겼어 도메인 3을 포함하는 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0.000345581 | 2.780297178 | 1.83072E - 06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E - 06 | 2.652516957 | 0.000206279 | |||
| 베꼈는데 시퀀스 | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E - 06 | 1.296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1 (F - spondin) 세포외 기질 단백질 | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E - 06 | 0.836181248 | 0.001380141 | ||
| calbindin - 28K | BB246032 | 1448738_at | 0.180317904 | 1.35961E - 05 | 0.647334052 | 4.12268E - 09 | ||
| 1 MARCKS 같은 | AV110584 | 1437226_x_at | 0.186235935 | 1.47067E - 06 | 0.499291387 | 2.34984E - 08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0.187783528 | 6.19122E - 05 | 0.8967688 | 0.282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0.188195795 | 0.000105295 | 0.915528892 | 0.35282097 | ||
| spondin 1 (F - spondin) 세포외 기질 단백질 | BQ175871 | 1442613_at | 0.189956563 | 9.41195E - 06 | 0.861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestin 3, 망막 | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E - 05 | 3.944218329 | 1.07437E - 07 | ||
| RIKEN cDNA 유전자 A330050F15 | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0.000119342 | 0.660282035 | 2.47342E - 05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0.194404608 | 4.08641E - 07 | 0.918742591 | 0.022545297 | ||
| calbindin - 28K | BB246032 | 1417504_at | 0.196381321 | 2.24182E - 05 | 0.619305124 | 3.6222E - 06 | ||
| gastrin는 펩타이드를 방출 | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E - 05 | 2.752845903 | 5.72954E - 07 | ||
| 수용체 3 포함 sortilin 관련 VPS10 도메인 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E - 05 | 1.29051599 | 0.029733649 | ||
| 도파민 수용체 D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E - 05 | 1.815881979 | 0.000516498 | ||
| proprotein convertase subtilisin / kexin 타입 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0.210528027 | 7.83039E - 05 | 0.574126078 | 9.15496E - 05 | ||
| 인터루킨 1 수용체, 나는을 입력 | NM_008362 | 1448950_at | 0.210572243 | 9.64524E - 06 | 0.241135352 | 2.79816E - 08 | ||
Disclosures
동물 실험 관리 및 실험실 동물의 사용에 대한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행하고, 후지타 보건 대학에서 동물 보호 및 사용위원회의 승인되었습니다.
Acknowledgments
우리는 영화에 그녀의 지원을 위해 해부의 기술과 후지타 보건 대학 부인 아키 미야 카와 그녀의지도 교토 대학에서 박사 요코 나베시마 감사합니다. 일본에서 MEXT에서 그리고에 의해 -이 작품은 바이오 메디컬 기술 혁신, 우선 분야 - 통합 뇌 연구 (Shien)에 학술 연구 보조금의 국립 연구소의 건강 과학 기초 연구의 진흥을위한 프로그램에 의해 지원되었다 그랜트 - - 에이드에서 일본의 과학 기술 기관의 크레스트에서.
References
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