Summary
A técnica de dissecção para a remoção do giro dentado de camundongos adultos sob um estereomicroscópio foi demonstrado neste protocolo de vídeo-gravadas.
Abstract
O hipocampo é uma das áreas mais estudadas no cérebro por causa de seu importante papel funcional no processamento da memória e aprendizagem, sua plasticidade neuronal de células notável, e seu envolvimento na epilepsia, doenças neurodegenerativas, e transtornos psiquiátricos. O hipocampo é composto de regiões distintas, o giro denteado, que compreende principalmente neurônios granulares, e buzina de Amon, que compreende principalmente os neurônios piramidais, e as duas regiões estão conectadas por ambos os circuitos anatômicos e funcionais. Muitos mRNAs e proteínas diferentes são seletivamente expresso no giro denteado, e giro denteado é um site de neurogênese adulta, isto é, novos neurônios são gerados continuamente no giro denteado adulto. Para investigar mRNA e proteína expressão específica para o giro denteado, laser microdissecção de captura é frequentemente utilizado. Este método tem algumas limitações, no entanto, como a necessidade de aparelhos especiais e procedimentos de manuseio complicado. Neste protocolo de vídeo-gravadas, que demonstram uma técnica de dissecção para a remoção do giro dentado de camundongos adultos sob um estereomicroscópio. Amostras giro denteado preparados com essa técnica são adequados para qualquer ensaio, incluindo transcriptomic, proteômica, e análises de biologia celular. Nós confirmamos que o tecido é dissecado giro denteado através da realização de PCR em tempo real de giro denteado genes específicos, triptofano 2,3-dioxigenase (TDO2) e desmoplakin (DSP), e genes de Amon chifre enriquecido, Meis relacionados 1b gene (Mrg1b ) e TYRO3 a proteína tirosina quinase 3 (Tyro3). As expressões de mRNA TDO2 e Dsp nas amostras de giro dentado foram detectados em níveis mais elevados, obviamente, enquanto Mrg1b e Tyro3 foram níveis mais baixos do que aqueles em amostras do Amon chifre. Para demonstrar a vantagem deste método, foi realizada análise de DNA microarray, utilizando amostras de hipocampo todo e giro denteado. A expressão de mRNA de TDO2 e DSP, que são expressos seletivamente no giro dentado, no hipocampo todo + / alfa-CaMKII - ratos, exibiu 0,037 e 0,10 vezes alterações em relação ao do tipo selvagem ratos, respectivamente. No giro denteado isolado, no entanto, estas expressões exibidas 0,011 e 0,021 vezes alterações em relação ao do tipo selvagem camundongos, demonstrando que as mudanças de expressão gênica no giro denteado pode ser detectada com maior sensibilidade. Tomados em conjunto, esta técnica de dissecção prático e preciso pode ser confiavelmente utilizado para estudos focado no giro dentado.
Protocol
Dissecção do giro denteado do hipocampo
- Em um rato anestesiado profundamente, cuidadosamente dissecar o cérebro fora do crânio e colocá-lo em gelada tampão fosfato (PBS).
- Numa placa de Petri contendo PBS gelado, cortar o cérebro ao longo da fissura longitudinal do cérebro usando um bisturi, e cortou as regiões posterior à lambda (mesencéfalo, rombencéfalo e cerebelo).
- Coloque o lado hemisfério cerebral medial para cima e, usando uma pinça, retire cuidadosamente o diencéfalo (tálamo e hipotálamo) sob um microscópio de dissecação. Isto irá expor o lado medial do hipocampo, permitindo a visualização do giro denteado. O giro denteado é distinguível de chifre de Amon pelas lacunas entre elas. Lesão do hipocampo ou área circundante tornará mais difícil isolar o giro denteado.
- Inserir uma afiada ponta da agulha (por exemplo, calibre 27 com agulha) em cada lado do giro denteado (limites do giro denteado e chifre de Amon; Figura 1) e deslize as agulhas superficialmente ao longo do eixo septo-temporal do hipocampo para isolar o giro denteado.
- Pegue o giro denteado isolados usando uma agulha ou pinça e colocá-lo em um tubo de amostra. A assim obtida amostra de tecido giro denteado pode ser usado imediatamente para qualquer ensaio ou armazenado em um congelador para uso posterior.
- Isolar o giro denteado do outro hemisfério cerebral usando o mesmo método.
Quantitativas PCR em tempo real
O giro dentado foi isolado usando o método acima mencionado eo hipocampo restante foi dissecados como amostra o Amon chifre de camundongos selvagens. PCR em tempo real da beta-actina, TDO2, Dsp, Mrg1b e Tyro3 foram realizadas com o giro denteado e amostras do Amon chifre como descrito anteriormente 1. Primers 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG e 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC foram usados para Mrg1b e GCCTCCAAATTGCCCGTCA e 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA para Tyro3.
Análise de microarray
Experimentos de microarray foram realizados com homens do tipo selvagem ratos e camundongos heterozigotos para o alfa-isoforma de cálcio / calmodulina-dependente da proteína quinase II (alfa-CaMKII + / - ratos), como descrito anteriormente 1. Resumidamente, RNA isolado do hipocampo todo ou giro dentado de camundongos do tipo selvagem e mutante foi hibridizado com um rato Genoma Matriz 430 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA), e cada GeneChip foi digitalizado por um GeneChip Affymetrix Scanner 3000 (GCS3000) . A análise foi realizada com GeneChip Microarray Analysis Suite versão 5.0.
Discussion
O giro denteado ocupa aproximadamente 25% a 30% do volume da formação do hipocampo 2,3. Ela tem uma composição única de células e desempenha um papel crucial em várias funções cerebrais. Portanto, as técnicas para isolar o giro denteado são úteis para analisar os eventos que ocorrem especificamente na região.
Aqui, nós demonstramos um procedimento de forma eficiente dissecar o giro denteado do hipocampo de camundongos adultos e confirmou a precisão da técnica. Primeiro, estudo histológico revelou que o giro denteado foi separado sem contaminação por outras regiões (Figura 1), indicando que uma amostra giro denteado puro pode ser preparado.
Segundo, que confirmou que o tecido é dissecado giro denteado através da realização de PCR em tempo real de giro denteado genes específicos, TDO2 e DSP, e genes de Amon chifre enriquecido, Mrg1b Tyro3 e 4 (Figura 2). As expressões mRNA de TDO2 (p = 0,000023; n é = 4 e 4, respectivamente) e DSP (p = 0,0000030; n é = 4 e 4, respectivamente) nas amostras de giro dentado foram detectados em níveis obviamente maior, enquanto Mrg1b (p = 0.000080, de n = 4 e 4, respectivamente) e Tyro3 (p = 0,00017; = 4 e 4, respectivamente) n foram níveis mais baixos do que aqueles em amostras do Amon chifre. Níveis de beta-actina expressão não diferiram nessas amostras (p = 0,11; n é = 4 e 4, respectivamente). Assim, poderíamos verificar se ou não o giro denteado foi exatamente dissecados através da realização de tais experimentos simples PCR em tempo real.
Terceiro, para avaliar a utilidade deste método de dissecação, que compararam o nível de expressão de mRNA do hipocampo todo com a de giro dentado. Hipocampo todo e giro denteado obtido a partir do tipo selvagem (= 9 e 4, n é, respectivamente) e alfa-CaMKII + / - ratos (= n 18 e 4, respectivamente) foram processadas para análise de microarray, e para todos os genes marcados, a vezes mudança foi calculado dividindo-se o valor mutante pelo valor do tipo selvagem. Os resultados indicaram que as mudanças na expressão de mRNA, especialmente de giro denteado-moléculas específicas, tais como Dsp e TDO2, foram detectados com um aumento de até cinco vezes na sensibilidade em amostras de giro denteado em comparação com todo amostras do hipocampo (Tabela 1). Nós já demonstraram que o alfa-CaMKII + / - exibem comportamentos relacionados com ratos humanos transtornos psiquiátricos, como déficit de memória de trabalho e um ritmo exagerado infradianos 1,5. Além disso, as características morfológicas e eletrofisiológicas dos neurônios do giro denteado em ratos mutantes são muito semelhantes aos dos neurônios imaturos giro dentado em roedores normais, indicando que os neurônios nesses ratos mutantes não conseguem desenvolver a maturidade 1. Os imaturos expressão giro e para baixo-regulado denteado de DSP e TDO2 mRNA em alfa-CaMKII + / - ratos são consistentes com a constatação de que Dsp e TDO2 podem ser usados como marcadores de células granulares madura no giro denteado (Ohira et al, inédito. dados).
Tomados em conjunto, esta técnica de dissecção prático e preciso pode ser confiavelmente utilizado para estudos focado no giro dentado. Tecido giro denteado obtidos utilizando este método é aplicável a outros tipos de análises, bem como, incluindo análises de biologia celular e proteômica.
Figura 1. Verificação do giro denteado isolado pelo estudo histológico. Uma seção coronal do cérebro após isolar giro dentado foi processado para a coloração de Nissl (painel esquerdo), e um esquema adaptado do cérebro do rato atlas6 representa o aproximadamente o mesmo nível da seção mostrado no painel da esquerda (painel direito). Setas indicam as direções da inserção ponta da agulha. Barra de escala, 1 mm.
Figura 2. Verificação do giro denteado isolado por PCR em tempo real. O giro denteado e chifre de Ammon s obtidos a partir de quatro camundongos selvagens foram processadas para PCR em tempo real da beta-actina, TDO2, Dsp, Mrg1b e Tyro3. Resultados são apresentados como média ± SEM. Para a análise estatística, teste t Student foi empregado s, e os valores p são seguidos: beta-actina, p = 0,11; TDO2, p = 0,000023 (** 1); Dsp, p = 0,0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3) e Tyro3, p = 0,00017 (** 4).
Tabela 1. . Microarray análise do hipocampo e giro denteado todo Genes diferencialmente expressos no giro denteado do hipocampo e toda a alfa-CaMKII + / - ratos foram determinados por cálculo a mudança vezes, de que a detectada em camundongos selvagens. Os dados foram analisados para significância estatística pelo teste t de Student entre os s do tipo selvagem e alfa-CaMKII + / - ratos. Entre os genes cuja expressão apresentaram p <0,05 emo giro denteado de + / alfa-CaMKII - ratos comparada com a de camundongos selvagens, o top 50 genes estão listados. Note que os números de amostras para giro denteado são muito menos do que os de hipocampo todo. AffyID, Affymetrix sonda identificador; CKII, alfa-CaMKII + / - ratos; WT, camundongos selvagens.
| Giro denteado (p <0,05) WT: n = 4, CKII + / -: n = 4 | Hipocampo todo WT: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| Título Gene | Bancos de Germoplasma | AffyID | Mudança vezes | valor de p | Mudança vezes | valor de p | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | 0,011018913 | 7.02694E-06 | 0,037021003 | 1.86126E-13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0,014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| triptofano 2,3-dioxigenase | AI098840 | 1419093_at | 0,020986484 | 5.23546E-09 | 0,101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0,075479901 | 1.05191E-08 | 0,234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0,079457767 | 1.40433E-07 | 0,177974715 | 3.9758E-12 | ||
| tirotropina liberação de receptores hormonais | M59811 | 1449571_at | 0,103105815 | 0,003093796 | 0,801412732 | 0,283994361 | ||
| rianodina receptor 1, músculo esquelético | X83932 | 1427306_at | 0,104825517 | 3.38513E-07 | 0,650685017 | 0,000308462 | ||
| helix helix um loop de ignorante | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4,078815314 | 5.27E-11 | ||
| família copine membro IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1,797304153 | 0,000296375 | ||
| doublecortin-like kinase 3 | BB326709 | 1436532_at | 0,109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| calpaína 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0,111269769 | 8.07053E-06 | 0,370956608 | 2.04421E-14 | ||
| Adulto masculino corpus striatum cDNA, RIKEN full-length enriquecido biblioteca, clone: C030023B07 produto: inclassificável, seqüência de inserção plena | BB357628 | 1460043_at | 0,118712341 | 6.16926E-07 | 0,682339204 | 2.33001E-06 | ||
| colágeno e cálcio EGF vinculativo domínios 1 | AV264768 | 1437385_at | 0,124043978 | 3.65669E-05 | 0,488394112 | 4.05538E-06 | ||
| beta-amilóide (A4) precursor protein-vinculativo família, A, membro 2 de ligação às proteínas | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2,099164713 | 1.67047E-06 | ||
| calbindina-28K | BB177770 | 1456934_at | 0,130255444 | 3.32186E-06 | 0,572605751 | 1.99157E-10 | ||
| Lócus transcrita | AV328597 | 1443322_at | 0,133290835 | 5.43583E-06 | 0,562767164 | 7.56544E-06 | ||
| neuropeptídeo Y receptor Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0,135319609 | 0,000113407 | 0,781498474 | 0.00394504 | ||
| ras proteína elemento responsivo binding 1 | BE197381 | 1428657_at | 0,138235114 | 7.93691E-07 | 0,651220705 | 2.94209E-05 | ||
| linhagem de células gliais derivadas receptor família neurotrófico fator alfa 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0,139062563 | 2.35371E-06 | 0,669544709 | 0,000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1,766018828 | 0,000250501 | ||
| RIKEN gene cDNA 1810010H24 | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| rianodina receptor 1, músculo esquelético | BG793713 | 1457347_at | 0,151364292 | 3.35612E-05 | 0,503144617 | 4.32907E-05 | ||
| protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0,152671849 | 8.57783E-06 | 0,670714726 | 1.56309E-05 | ||
| cornichon homólogo 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0,153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | 0,661055608 | ||
| harakiri, BCL2 proteínas que interagem (contém apenas BH3 domínio) | BQ175572 | 1439854_at | 0,154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| carboidratos (N-acetilgalactosamina 4-0) sulfotransferase 9 | AK017407 | 1431897_at | 0,155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | 0,215637733 | ||
| calpaína 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0,160871988 | 1.07655E-05 | 0,477164757 | 1.33753E-11 | ||
| dedo de zinco, de domínio CCHC contendo 5 | BQ126004 | 1437355_at | 0,161812078 | 3.08262E-06 | 0,421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrina | NM_008508 | 1448745_s_at | 0,165129967 | 1.86362E-05 | 0,639733409 | 0,000729772 | ||
| spondin 1, (f-spondin) proteínas da matriz extracelular | BC020531 | 1451342_at | 0,168035879 | 6.67867E-07 | 0,821042412 | 0,023650765 | ||
| RIKEN gene A930035E12 cDNA | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1,470383201 | 0,104085454 | ||
| BB247294 RIKEN full-length enriquecido, 7 dias neonato cerebelo Mus musculus clone cDNA A730018G18 3 ', seqüência de mRNA. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1,968147585 | 0.00010636 | ||
| Domínio FERM contendo 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0,000345581 | 2,780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2,652516957 | 0,000206279 | |||
| Seqüências transcritas | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1,296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1, (f-spondin) proteínas da matriz extracelular | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | 0,836181248 | 0,001380141 | ||
| calbindina-28K | BB246032 | 1448738_at | 0,180317904 | 1.35961E-05 | 0,647334052 | 4.12268E-09 | ||
| Marcks-like 1 | AV110584 | 1437226_x_at | 0,186235935 | 1.47067E-06 | 0,499291387 | 2.34984E-08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0,187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0,282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0,188195795 | 0,000105295 | 0,915528892 | 0.35282097 | ||
| spondin 1, (f-spondin) proteínas da matriz extracelular | BQ175871 | 1442613_at | 0,189956563 | 9.41195E-06 | 0,861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestina 3, da retina | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3,944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN gene A330050F15 cDNA | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0,000119342 | 0,660282035 | 2.47342E-05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0,194404608 | 4.08641E-07 | 0,918742591 | 0,022545297 | ||
| calbindina-28K | BB246032 | 1417504_at | 0,196381321 | 2.24182E-05 | 0,619305124 | 3.6222E-06 | ||
| peptídeo liberador de gastrina | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2,752845903 | 5.72954E-07 | ||
| sortilin relacionadas com o domínio VPS10 contendo receptor 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | 0,029733649 | ||
| receptor de dopamina D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1,815881979 | 0,000516498 | ||
| proprotein convertase tipo subtilisina / Kexin 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0,210528027 | 7.83039E-05 | 0,574126078 | 9.15496E-05 | ||
| interleucina 1 receptor, do tipo I | NM_008362 | 1448950_at | 0,210572243 | 9.64524E-06 | 0,241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
Experimentos com animais foram realizados de acordo com o Instituto Nacional do Guia de Saúde para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e aprovado pelo comitê de cuidados com animais e uso em Fujita Saúde University.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Yoko Nabeshima da Universidade de Kyoto para a sua instrução sobre a técnica de dissecação e Aki Ms. Miyakawa em Fujita Saúde da Universidade, pelo seu apoio ao filme. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Promoção de Estudos Fundamentais em Ciências da Saúde do Instituto Nacional de Inovação Biomédica, um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em Áreas Prioritárias-Integrativa Brain Research (Shien) - de MEXT no Japão, e por um Grant-in-Aid da CREST da Ciência do Japão e Agência de Tecnologia.
References
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