Summary
Рассечение технику для удаления зубчатой извилине от взрослой мыши в стереомикроскопа была продемонстрирована в этой видеозаписи протокол.
Abstract
Гиппокамп является одним из наиболее широко изучаемых областей в мозге из-за его важную функциональную роль в обработке памяти и обучения, его замечательных нейронной пластичности ячейки, и его участие в эпилепсии, нейродегенеративных заболеваний и психических расстройств. Гиппокамп состоит из различных регионов; зубчатой извилине, которая состоит в основном из гранул нейронов, и рога Аммона, который состоит в основном из пирамидных нейронов, и два региона связаны как анатомических и функциональных схем. Много различных мРНК и белков, избирательно выражается в зубчатой извилине, и зубчатой извилине это сайт взрослого нейрогенеза, то есть новые нейроны постоянно генерируется в зубчатой извилине взрослых. Для исследования мРНК и экспрессии белка, характерные для зубчатой извилине, лазерная захвата микродиссекции часто используется. Этот метод имеет некоторые ограничения, однако, такие, как потребность в специальных аппаратах и сложные процедуры обработки. В этом видео-протокол записали, мы демонстрируем рассечение технику для удаления зубчатой извилине от взрослой мыши в стереомикроскопа. Зубчатой извилины образцы подготовлены с использованием этой методики подходят для любого анализа, в том числе transcriptomic, протеомных, и клеточной биологии анализов. Мы подтвердили, что расчлененный ткани зубчатой извилине путем проведения ПЦР в реальном времени в зубчатой извилине-специфических генов, триптофан 2,3-dioxygenase (TDO2) и desmoplakin (DSP), и рога Аммона обогащенные генами, Мейс-родственный ген 1b (Mrg1b ) и TYRO3 белка тирозинкиназы 3 (Tyro3). МРНК выражения TDO2 и ДСП в зубчатой извилине образцах были обнаружены на явно более высокие уровни, в то время как Mrg1b и Tyro3 были более низких уровнях, чем те, в образцах Аммона рога. Чтобы продемонстрировать преимущество этого метода, мы провели анализ ДНК-микрочипов с использованием образцов целом гиппокампа и зубчатой извилины. Экспрессию мРНК TDO2 и DSP, которые выражаются выборочно в зубчатой извилине, в целом гиппокампе альфа-CaMKII + / - мышей, выставлены 0,037 и 0,10 раза изменений по сравнению с мышами дикого типа, соответственно. В изолированных зубчатой извилине, однако, эти выражения выставлены 0,011 и 0,021 раза изменений по сравнению с мышами дикого типа, демонстрируя, что экспрессия генов изменения в зубчатой извилине могут быть обнаружены с большей чувствительностью. Взятые вместе, это удобный и точный метод вскрытия могут быть надежно использованы для исследования сосредоточены на зубчатой извилины.
Protocol
Препарирование зубчатой извилине гиппокампа
- В глубоко под наркозом мыши, тщательно препарировать мозг из черепа и поместить его в ледяную фосфатным буферным раствором (PBS).
- В чашке Петри содержащие ледяной PBS, вырезать мозг вдоль продольной щели головного мозга использованием хирургического ножа, и отрезали регионах кзади от лямбда (средний мозг, задний мозг, и мозжечок).
- Место полушария медиальной стороной вверх и, используя щипцы, осторожно удалите промежуточного мозга (таламуса и гипоталамуса) под микроскопом рассечение. Это выставит медиальной стороны гиппокампа, что позволяет для визуализации зубчатой извилины. Зубчатой извилине отличим от рога Аммона на пробелы между ними. Повреждение гиппокампа и соседним областям сделает его более трудно выделить зубчатой извилины.
- Вставьте острой иглой-наконечником (например, 27-иглы) в каждую сторону зубчатой извилине (границы зубчатой извилине и рога Аммона; рис. 1) и сдвиньте иглы поверхностно вдоль септо-временной оси гиппокампа, чтобы изолировать зубчатой извилины.
- Возьмите изолированных зубчатой извилине с помощью иглы или пинцета и поместить его в пробирку. Таким образом, получены зубчатой извилине образец ткани можно использовать сразу для любого анализа или хранить в морозильнике для последующего использования.
- Изолировать зубчатой извилине от другого полушария, используя тот же метод.
Количественный ПЦР в реальном времени
Зубчатой извилине выделяли с использованием вышеупомянутого метода, а остальные гиппокамп был расчлененный в качестве образца рога Аммона от мышей дикого типа. ПЦР в реальном времени бета-актин, TDO2, DSP, Mrg1b и Tyro3 проводились с зубчатой извилине и рога Аммона образцы, как описано выше 1. Грунтовки 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG и 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC были использованы для Mrg1b и GCCTCCAAATTGCCCGTCA и 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA для Tyro3.
Microarray анализ
Microarray были проведены эксперименты с мужской мышей дикого типа и мышей, гетерозиготных по альфа-изоформы кальций / кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (альфа-CaMKII + / - мышей), как описано выше 1. Кратко, РНК, выделенной из целого гиппокампе или зубчатой извилине дикого типа и мутантных мышей гибридизации с геноме мыши 430 2,0 Array (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния), и каждый GeneChip было проверено Affymetrix GeneChip сканера 3000 (GCS3000) . GeneChip анализ проводился с Microarray Анализ Suite Version 5.0.
Discussion
Зубчатой извилины занимает примерно 25% до 30% от объема гиппокампа 2,3. Он имеет уникальный состав клеток и играет важную роль в различных функциях мозга. Таким образом, методы, чтобы изолировать зубчатой извилине полезны для анализа событий, которые происходят именно в этом регионе.
Здесь мы показали, процедура эффективно анализировать зубчатой извилине гиппокампа от взрослой мыши и подтвердил точность этого метода. Во-первых, гистологические исследования показали, что зубчатая извилина был отделен без загрязнения в других регионах (рис. 1), что свидетельствует о чистом зубчатой извилине образец может быть подготовлен.
Во-вторых, мы подтвердили, что расчлененный ткани зубчатой извилине путем проведения ПЦР в реальном времени в зубчатой извилине конкретных генов, TDO2 и DSP, и рога Аммона обогащенные генами, Mrg1b и Tyro3 4 (рис. 2). МРНК выражения TDO2 (р = 0,000023, п в = 4 и 4 соответственно) и DSP (р = 0,0000030, п в = 4 и 4 соответственно) в зубчатой образцы извилины были обнаружены на явно более высокие уровни, в то время как Mrg1b (р = 0.000080, п в = 4 и 4 соответственно) и Tyro3 (р = 0,00017; л в = 4 и 4, соответственно) были более низких уровнях, чем те, в рог Аммона образцов. Бета-актин уровень экспрессии не отличались в этих образцах (р = 0,11, п в = 4 и 4 соответственно). Таким образом, мы могли бы узнать, было ли зубчатой извилине было точно расчлененное из путем проведения таких простых ПЦР в реальном времени экспериментов.
В-третьих, оценить полезность этого метода вскрытия, мы сравнили уровень экспрессии мРНК целых гиппокамп с этим в зубчатой извилине. Всего гиппокампе и зубчатой извилине получены от дикого типа (п в = 9 и 4 соответственно) и альфа-CaMKII + / - мышей (= п на 18 и 4 соответственно) были обработаны для анализа микрочипов, а также для всех генов, забил, раз- изменение рассчитывается путем деления стоимости мутантов дикого типа значения. Результаты показали, что изменения в экспрессии мРНК, особенно зубчатой извилине конкретных молекул, таких как ДСП и TDO2, были обнаружены до 5-кратное увеличение чувствительности в зубчатой извилине образцов по сравнению с целого гиппокампа образцов (табл. 1). Ранее мы показали, что альфа-CaMKII + / - поведение мышей выставки, связанные с человеческой психических расстройств, таких как рабочая память дефицита и преувеличенные infradian ритм 1,5. Кроме того, морфологические и электрофизиологические особенности нейронов зубчатой извилины у мутантных мышей, поразительно похожи на тех, незрелых нейронов зубчатой извилины в нормальных грызунов, указывая, что нейроны в этих мутантных мышей не развиваются до погашения 1. Незрелые зубчатой выражение извилины и вниз регулируемых сигнальных процессоров и TDO2 мРНК альфа-CaMKII + / - мышей согласуются с выводом, что цифровой обработки сигналов и TDO2 могут быть использованы в качестве маркеров зрелых клеток гранулы в зубчатой извилине (Охира и др., не опубликовано. данные).
Взятые вместе, это удобный и точный метод вскрытия могут быть надежно использованы для исследования сосредоточены на зубчатой извилины. Зубчатой извилины ткани полученные с помощью этого метода могут быть освоены другие виды анализов, а также, в том числе протеомных и клеточной биологии анализы.
Рисунок 1. Проверка изолированных зубчатой извилине на гистологическое исследование. Корональной части мозга после изоляции зубчатой извилине было обработано для Нисслю окрашивания (слева), и схема адаптирована из мозга мышей atlas6 представляет примерно тот же уровень разделе показано на левой панели (правая панель). Стрелки указывают направления иглы наконечника вставки. Шкала бар, 1 мм.
Рисунок 2. Проверка изолированных зубчатой извилине по ПЦР в реальном времени. Зубчатой извилины и рога Аммона с получены от четырех мышей дикого типа были обработаны для ПЦР в реальном времени бета-актин, TDO2, DSP, Mrg1b и Tyro3. Результаты представлены как средние значения ± SEM. Для статистического анализа, т теста Стьюдента с работала, и р значения следуют: бета-актин, р = 0,11; TDO2, р = 0,000023 (** 1); DSP, р = 0,0000030 (** 2); Mrg1b, р = 0.000080 (** 3), а Tyro3, р = 0,00017 (** 4).
Таблица 1. . Microarray анализ целого гиппокампе и зубчатой извилине Гены разному экспрессируются в зубчатой извилине гиппокампа и целые альфа-CaMKII + / - мышей определяется путем подсчета диван-переход от том, что обнаруженные в мышей дикого типа. Данные были проанализированы на статистическую значимость использования т тест Студенческая х годах между дикого типа и альфа-CaMKII + / - мышей. Среди генов, экспрессия выставлены р <0,05 взубчатой извилине альфа-CaMKII + / - мышей по сравнению с мышами дикого типа, топ-50 генов перечислены. Обратите внимание, что количество образцов для зубчатой извилине гораздо меньше, чем за весь гиппокампе. AffyID, Affymetrix зонд идентификатор; CKII, альфа-CaMKII + / - мышей; WT, мышей дикого типа.
| Зубчатой извилине (р <0,05) WT: п = 4, CKII + / -: п = 4 | Всего гиппокампе WT: п = 9, CKII + / -: п = 18 | |||||||
| Гена Название | Генных банков | AffyID | Повязку меняют | значение р | Повязку меняют | значение р | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | 0,011018913 | 7.02694E-06 | 0,037021003 | 1.86126E-13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0,014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| триптофан 2,3-dioxygenase | AI098840 | 1419093_at | 0,020986484 | 5.23546E-09 | 0,101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0,075479901 | 1.05191E-08 | 0,234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0,079457767 | 1.40433E-07 | 0,177974715 | 3.9758E-12 | ||
| тиреотропин рилизинг гормона рецептором | M59811 | 1449571_at | 0,103105815 | 0,003093796 | 0,801412732 | 0,283994361 | ||
| рианодиновых рецепторов 1, скелетных мышцах | X83932 | 1427306_at | 0,104825517 | 3.38513E-07 | 0,650685017 | 0,000308462 | ||
| невежественной спирали цикл спирали 1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4,078815314 | 5.27E-11 | ||
| КОПИНЕ члена семьи IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1,797304153 | 0,000296375 | ||
| doublecortin-подобные киназы 3 | BB326709 | 1436532_at | 0,109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| кальпаин 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0,111269769 | 8.07053E-06 | 0,370956608 | 2.04421E-14 | ||
| Взрослый самец стриатума корпус кДНК, RIKEN полнометражный обогащенного библиотека, клон: C030023B07 продукта: неклассифицируемые, полная последовательность вставки | BB357628 | 1460043_at | 0,118712341 | 6.16926E-07 | 0,682339204 | 2.33001E-06 | ||
| коллагена и кальция обязательной ЭФР доменов 1 | AV264768 | 1437385_at | 0,124043978 | 3.65669E-05 | 0,488394112 | 4.05538E-06 | ||
| бета-амилоид (A4) белка-предшественника обязательными, семья, член 2 белка, связывающего | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2,099164713 | 1.67047E-06 | ||
| кальбиндин-28К | BB177770 | 1456934_at | 0,130255444 | 3.32186E-06 | 0,572605751 | 1.99157E-10 | ||
| Трансляции локус | AV328597 | 1443322_at | 0,133290835 | 5.43583E-06 | 0,562767164 | 7.56544E-06 | ||
| нейропептида Y рецепторов Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0,135319609 | 0,000113407 | 0,781498474 | 0.00394504 | ||
| РАН реагировать элемент связывающий белок 1 | BE197381 | 1428657_at | 0,138235114 | 7.93691E-07 | 0,651220705 | 2.94209E-05 | ||
| глиальных клеточной линии нейротрофического семейства рецепторов альфа-фактора 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0,139062563 | 2.35371E-06 | 0,669544709 | 0,000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1,766018828 | 0,000250501 | ||
| RIKEN кДНК гена 1810010H24 | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| рианодиновых рецепторов 1, скелетных мышцах | BG793713 | 1457347_at | 0,151364292 | 3.35612E-05 | 0,503144617 | 4.32907E-05 | ||
| protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0,152671849 | 8.57783E-06 | 0,670714726 | 1.56309E-05 | ||
| cornichon гомолога 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0,153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | 0,661055608 | ||
| харакири, Bcl2 взаимодействии белка (содержит только BH3 домен) | BQ175572 | 1439854_at | 0,154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| углеводов (N-ацетилгалактозамина 4-0) sulfotransferase 9 | AK017407 | 1431897_at | 0,155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | 0,215637733 | ||
| кальпаин 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0,160871988 | 1.07655E-05 | 0,477164757 | 1.33753E-11 | ||
| цинковых пальцев, КЧК области, содержащей 5 | BQ126004 | 1437355_at | 0,161812078 | 3.08262E-06 | 0,421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0,165129967 | 1.86362E-05 | 0,639733409 | 0,000729772 | ||
| spondin 1, (е-spondin) внеклеточных белков матрицы | BC020531 | 1451342_at | 0,168035879 | 6.67867E-07 | 0,821042412 | 0,023650765 | ||
| RIKEN кДНК гена A930035E12 | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1,470383201 | 0,104085454 | ||
| BB247294 RIKEN полнометражный обогащенный, 7 дней новорожденного мозжечка Mus мышцы кДНК клона A730018G18 3 ', мРНК последовательности. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1,968147585 | 0.00010636 | ||
| FERM домена, содержащий 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0,000345581 | 2,780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2,652516957 | 0,000206279 | |||
| Трансляции последовательностей | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1,296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1, (е-spondin) внеклеточных белков матрицы | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | 0,836181248 | 0,001380141 | ||
| кальбиндин-28К | BB246032 | 1448738_at | 0,180317904 | 1.35961E-05 | 0,647334052 | 4.12268E-09 | ||
| Маркса, как 1- | AV110584 | 1437226_x_at | 0,186235935 | 1.47067E-06 | 0,499291387 | 2.34984E-08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0,187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0,282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0,188195795 | 0,000105295 | 0,915528892 | 0.35282097 | ||
| spondin 1, (е-spondin) внеклеточных белков матрицы | BQ175871 | 1442613_at | 0,189956563 | 9.41195E-06 | 0,861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestin 3, сетчатки | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3,944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN кДНК гена A330050F15 | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0,000119342 | 0,660282035 | 2.47342E-05 | ||
| Contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0,194404608 | 4.08641E-07 | 0,918742591 | 0,022545297 | ||
| кальбиндин-28К | BB246032 | 1417504_at | 0,196381321 | 2.24182E-05 | 0,619305124 | 3.6222E-06 | ||
| гастрина выпуская пептид | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2,752845903 | 5.72954E-07 | ||
| sortilin связанных VPS10 области, содержащей рецептор 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | 0,029733649 | ||
| дофаминовых рецепторов Д1А | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1,815881979 | 0,000516498 | ||
| proprotein конвертазы субтилизина / Кэсинь тип 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0,210528027 | 7.83039E-05 | 0,574126078 | 9.15496E-05 | ||
| интерлейкина 1 рецептор, типа я | NM_008362 | 1448950_at | 0,210572243 | 9.64524E-06 | 0,241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и утверждается ухода за животными и использовать комитета при Фуджита здравоохранения университета.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Йоко Набэсима в Киотском университете для нее инструкцию по технике вскрытия и г-жа Аки Миякава на Фуджита здравоохранения Университета за ее поддержку в фильм. Работа выполнена при финансовой поддержке Программы содействия развитию фундаментальных исследований в области здравоохранения наук Национального института биомедицинских инноваций, субсидия для научных исследований в приоритетных областях, интегративной Brain Research (Шиен) - от MEXT в Японии, а также Грант-в-помощь от CREST из Японии науки и технологий агентства.
References
- Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
- Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
- Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
- Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
- Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press Inc.. San Diego. (1997).
