Summary
En dissektion teknik för borttagning av dentate gyrus från vuxna möss i ett stereomikroskop visades i denna video-inspelade protokollet.
Abstract
Hippocampus är en av de mest studerade områden i hjärnan på grund av dess viktiga funktionella roll i minnet bearbetning och inlärning, dess märkliga neuronal cell plasticitet, och sitt engagemang i epilepsi, neurodegenerativa sjukdomar, och psykiska störningar. Hippocampus är sammansatt av olika regioner, den dentate gyrus, som omfattar främst granulat nervceller, och Ammons horn, som omfattar främst pyramidal nervceller, och de två regionerna är anslutna genom både anatomiska och funktionella kretsar. Många olika mRNA och proteiner selektivt uttrycks i dentate gyrus, och dentate gyrus är en sajt för vuxna neurogenes, det vill säga nya nervceller ständigt nybildas i en vuxen dentate gyrus. För att undersöka mRNA och protein uttryck som är specifika för dentate gyrus, är laser fånga microdissection används ofta. Denna metod har vissa begränsningar dock, såsom behovet av särskilda apparater och komplicerade förfaranden hantering. I denna video-inspelade-protokollet, visar vi en dissektion teknik för att ta bort dentate gyrus från vuxna möss i ett stereomikroskop. Dentate gyrus prov som har beretts med den här tekniken lämpar sig för någon analys, inklusive transcriptomic, proteomik och cellbiologi analyser. Vi bekräftade att dissekeras vävnaden dentate gyrus genom att bedriva realtids-PCR för dentate gyrus-specifika gener, tryptofan 2,3-dioxygenase (TDO2) och desmoplakin (DSP), och Ammons horn berikad gener, Meis-relaterade genen 1b (Mrg1b ) och TYRO3 protein tyrosinkinas 3 (Tyro3). MRNA uttryck av TDO2 och DSP i dentate gyrus proverna upptäcktes vid tydligen högre nivåer, medan Mrg1b och Tyro3 var lägre nivåer än i Ammons horn prover. För att visa fördelen med denna metod genomförde vi DNA microarray analys med prover av hela hippocampus och dentate gyrus. MRNA uttryck av TDO2 och DSP, som uttrycks selektivt i dentate gyrus, i hela hippocampus av alfa-CaMKII + / - möss, visade 0,037 och 0,10 gånger förändringar jämfört med den vildtyp möss, respektive. I den isolerade dentate gyrus dock uppvisade dessa uttryck 0,011 och 0,021 gånger förändringar jämfört med den vildtyp möss, visar att förändringar genuttryck i dentate gyrus kan upptäckas med större känslighet. Sammantaget kan detta bekvämt och exakt dissektion teknik på ett tillförlitligt sätt användas för studier fokuserat på dentate gyrus.
Protocol
Dissekering av hippocampus dentate gyrus
- I ett djupt sövda mus, noggrant dissekera hjärnan ut från skallen och placera den i iskallt fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- I en petriskål med iskall PBS, skär hjärnan längs den längsgående spricka i hjärnan med hjälp av en kirurgisk kniv och skar av regionerna posteriort lambda (mitthjärnan, hindbrain och lillhjärnan).
- Placera hjärnhalva mediala sidan upp och med hjälp av pincett, försiktigt bort diencephalon (thalamus och hypothalamus) under en dissektion mikroskop. Detta kommer att utsätta den mediala sidan av hippocampus, vilket möjliggör visualisering av dentate gyrus. Den dentate gyrus skiljer sig från Ammons horn av klyftorna mellan dem. Skador på hippocampus eller omgivande område kommer att göra det svårare att isolera dentate gyrus.
- Sätt en vass nål-tip (t.ex. 27-gauge kanyl) i varje sida av dentate gyrus (gränser dentate gyrus och Ammon horn, Figur 1) och skjut nålar ytligt längs septo-temporala axeln i hippocampus att isolera den dentate gyrus.
- Plocka upp den isolerade dentate gyrus med hjälp av en nål eller pincett och placera den i ett provrör. Den sålunda framställda dentate gyrus vävnadsprov kan användas direkt för någon analys eller lagras i en djup-frysen för senare användning.
- Isolera dentate gyrus från andra hjärnhalva med samma metod.
Kvantitativa realtids-PCR
Den dentate gyrus var isolerad med ovan nämnda metod och resterande hippocampus var dissekeras ut som Ammons horn prov från vildtyp möss. Realtids-PCR av beta-aktin, TDO2, DSP, Mrg1b och Tyro3 utfördes med dentate gyrus och Ammons proverna horn som beskrivits tidigare 1. Primers 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG och 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC användes för Mrg1b och GCCTCCAAATTGCCCGTCA och 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA för Tyro3.
Microarray analys
Microarray experiment utfördes med manliga vildtyp möss och möss heterozygot för alfa-isoformen av kalcium / calmodulin-beroende protein kinas II (alfa-CaMKII + / - möss) som beskrivits tidigare 1. Kortfattat var RNA isolerat från hela hippocampus eller dentate gyrus av vildtyp och muterade möss hybridiseras med musens arvsmassa 430 2,0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA), och varje GeneChip var skannas av en Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (GCS3000) . GeneChip Analysen utfördes med microarray analys Suite version 5.0.
Discussion
Den dentate gyrus upptar cirka 25% till 30% av volymen av hippocampus bildandet 2,3. Den har en unik cell sammansättning och spelar avgörande roller i olika hjärnfunktioner. Därför tekniker för att isolera dentate gyrus är användbart för att analysera de händelser som inträffar just i denna region.
Här visade vi ett förfarande för att effektivt dissekera den dentate gyrus från vuxna möss hippocampus och bekräftade precisionen av tekniken. Först visade histologisk studie att dentate gyrus skildes utan kontaminering från andra regioner (figur 1), vilket indikerar att en ren dentate gyrus prov kan förberedas.
För det andra bekräftade vi att dissekeras vävnaden dentate gyrus genom att bedriva realtids-PCR för dentate gyrus-specifika gener, TDO2 och DSP, och Ammons horn berikad gener, Mrg1b och Tyro3 4 (figur 2). MRNA uttryck av TDO2 (p = 0,000023, N: s = 4 och 4, respektive) och DSP (p = 0,0000030, N: s = 4 och 4, respektive) i dentate gyrus proverna upptäcktes vid tydligen högre nivåer, medan Mrg1b (p = 0.000080, N: s = 4 och 4, respektive) och Tyro3 (p = 0,00017; N: s = 4 och 4, respektive) var lägre nivåer än i Ammons horn prover. Beta-aktin uttryck nivåerna skilde sig inte i dessa prover (p = 0,11, N: s = 4 och 4, respektive). Således kunde vi kontrollera huruvida dentate gyrus exakt var dissekeras ut genom att utföra sådana enkla realtids-PCR-experiment.
Tredje, för att bedöma nyttan av denna dissekeringsmetod, jämförde vi nivån mRNA uttryck för hela hippocampus med det av dentate gyrus. Hela hippocampus och dentate gyrus från vildtyp (n s = 9 och 4, respektive) och alfa-CaMKII + / - möss (N: s = 18 och 4, respektive) har behandlats för microarray analys, och för alla gener gjorde det fold- Förändringen beräknas genom att dividera den muterade värdet av vildtyp värde. Resultaten visade att förändringar i mRNA uttryck, särskilt av dentate gyrus-specifika molekyler som DSP och TDO2, upptäcktes med upp till en 5-faldig ökning av känsligheten i dentate gyrus prover jämfört med hela hippocampus prover (tabell 1). Vi visade tidigare att alfa-CaMKII + / - möss uppvisar beteenden relaterade till mänskliga psykiatriska tillstånd såsom arbetsminne underskott och en överdriven infradian rytm 1,5. Dessutom morfologiska och elektrofysiologisk funktioner i dentate gyrus nervceller i muterade möss är slående liknar omogna dentate gyrus nervceller i normala gnagare, vilket visar att nervceller i dessa muterade mössen inte utvecklas till mognad 1. Den omogna dentate gyrus och ned-reglerade uttryck för DSP och TDO2 mRNA i alfa-CaMKII + / - möss överensstämmer med konstaterandet att DSP och TDO2 kan användas som markörer av mogna granule celler i dentate gyrus (Ohira et al, opublicerade. data).
Sammantaget kan detta bekvämt och exakt dissektion teknik på ett tillförlitligt sätt användas för studier fokuserat på dentate gyrus. Dentate gyrus vävnad som erhålls med denna metod är tillämpliga på andra typer av analyser samt, inklusive proteomik och cellbiologi analyser.
Figur 1. Kontroll av isolerade dentate gyrus av histologisk studie. En koronalt del av hjärnan efter att isolera dentate gyrus bearbetades för Nissl färgning (till vänster) och en schematisk bild anpassad från mus hjärnan atlas6 representerar ungefär samma nivå av avsnittet som visas i panelen till vänster (höger panel). Pilarna anger riktningarna för nål-spetsen insättningen. Skala bar, 1 mm.
Figur 2. Kontroll av isolerade dentate gyrus av realtids-PCR. Den dentate gyrus och Ammon s hornet från fyra vildtyp möss som behandlats för realtids-PCR av beta-aktin, TDO2, DSP, Mrg1b och Tyro3. Resultaten presenteras som medel ± SEM. För statistisk analys, var Student s t-test används, och p värden följs: beta-aktin, p = 0,11; TDO2, p = 0,000023 (** 1), DSP, p = 0,0000030 (** 2), Mrg1b, p = 0.000080 (** 3), och Tyro3, p = 0,00017 (** 4).
Tabell 1. . Microarray analys av hela hippocampus och dentate gyrus Gener differentiellt uttryckta i dentate gyrus och hela hippocampus av alfa-CaMKII + / - möss hade fastställts genom beräkning av fold-förändringen från att upptäckas i vildtyp möss. Data analyserades för statistisk signifikans med Student T test mellan vildtyp och alfa-CaMKII + / - möss. Bland de gener vars uttryck ställde ut p <0,05 iden dentate gyrus av alfa-CaMKII + / - möss jämfört med den vildtyp möss, är de 50 generna i listan. Observera att antal prov för dentate gyrus är mycket mindre än för hela hippocampus. AffyID, Affymetrix sond identifierare, CKII, alfa-CaMKII + / - möss, WT, vildtyp möss.
| Dentate gyrus (p <0,05) WT: n = 4, CKII + / -: n = 4 | Hela hippocampus WT: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| Gene Titel | Genebank | AffyID | Vik förändring | p-värde | Vik förändring | p-värde | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | 0,011018913 | 7.02694E-06 | 0,037021003 | 1.86126E-13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0,014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| tryptofan 2,3-dioxygenase | AI098840 | 1419093_at | 0,020986484 | 5.23546E-09 | 0,101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0,075479901 | 1.05191E-08 | 0,234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0,079457767 | 1.40433E-07 | 0,177974715 | 3.9758E-12 | ||
| tyreotropin hormon-receptor | M59811 | 1449571_at | 0,103105815 | 0,003093796 | 0,801412732 | 0,283994361 | ||
| ryanodine receptor 1, skelettmuskel | X83932 | 1427306_at | 0,104825517 | 3.38513E-07 | 0,650685017 | 0,000308462 | ||
| AGNOSTIKER helix slinga helix 1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4,078815314 | 5.27E-11 | ||
| COPINE familjemedlem IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1,797304153 | 0,000296375 | ||
| doublecortin-liknande kinas 3 | BB326709 | 1436532_at | 0,109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| calpain 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0,111269769 | 8.07053E-06 | 0,370956608 | 2.04421E-14 | ||
| Vuxna manliga corpus striatum cDNA, RIKEN fullängds berikade bibliotek, klon: C030023B07 produkt: unclassifiable, full sätter sekvensen | BB357628 | 1460043_at | 0,118712341 | 6.16926E-07 | 0,682339204 | 2.33001E-06 | ||
| kollagen och kalcium bindande EGF-domäner 1 | AV264768 | 1437385_at | 0,124043978 | 3.65669E-05 | 0,488394112 | 4.05538E-06 | ||
| amyloid beta (A4) prekursor protein-bindande, familj A, ledamot 2 protein | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2,099164713 | 1.67047E-06 | ||
| calbindin-28K | BB177770 | 1456934_at | 0,130255444 | 3.32186E-06 | 0,572605751 | 1.99157E-10 | ||
| Kopierat locus | AV328597 | 1443322_at | 0,133290835 | 5.43583E-06 | 0,562767164 | 7.56544E-06 | ||
| neuropeptid Y-receptorn Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0,135319609 | 0,000113407 | 0,781498474 | 0.00394504 | ||
| Ras lyhörd inslag bindande protein 1 | BE197381 | 1428657_at | 0,138235114 | 7.93691E-07 | 0,651220705 | 2.94209E-05 | ||
| gliaceller cellinje neurotrofa faktor familj receptor alfa 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0,139062563 | 2.35371E-06 | 0,669544709 | 0,000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1,766018828 | 0,000250501 | ||
| RIKEN cDNA 1810010H24 gen | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| ryanodine receptor 1, skelettmuskel | BG793713 | 1457347_at | 0,151364292 | 3.35612E-05 | 0,503144617 | 4.32907E-05 | ||
| protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0,152671849 | 8.57783E-06 | 0,670714726 | 1.56309E-05 | ||
| cornichon homolog 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0,153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | 0,661055608 | ||
| Harakiri, BCL2 samverkande protein (innehåller endast BH3 domän) | BQ175572 | 1439854_at | 0,154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| kolhydrat (N-acetylgalaktosamin 4-0) sulfotransferase 9 | AK017407 | 1431897_at | 0,155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | 0,215637733 | ||
| calpain 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0,160871988 | 1.07655E-05 | 0,477164757 | 1.33753E-11 | ||
| zink finger, CCHC domän som innehåller 5 | BQ126004 | 1437355_at | 0,161812078 | 3.08262E-06 | 0,421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0,165129967 | 1.86362E-05 | 0,639733409 | 0,000729772 | ||
| spondin 1, (f-spondin) extracellulära matrix protein | BC020531 | 1451342_at | 0,168035879 | 6.67867E-07 | 0,821042412 | 0,023650765 | ||
| RIKEN cDNA A930035E12 gen | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1,470383201 | 0,104085454 | ||
| BB247294 RIKEN fullängds berikad, 7 dagar nyfödda lillhjärnan Mus musculus cDNA klon A730018G18 3 ", mRNA sekvens. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1,968147585 | 0.00010636 | ||
| Ferm domän som innehåller 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0,000345581 | 2,780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2,652516957 | 0,000206279 | |||
| Kopierat sekvenser | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1,296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1, (f-spondin) extracellulära matrix protein | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | 0,836181248 | 0,001380141 | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1448738_at | 0,180317904 | 1.35961E-05 | 0,647334052 | 4.12268E-09 | ||
| Marcks-liknande 1 | AV110584 | 1437226_x_at | 0,186235935 | 1.47067E-06 | 0,499291387 | 2.34984E-08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0,187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0,282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0,188195795 | 0,000105295 | 0,915528892 | 0.35282097 | ||
| spondin 1, (f-spondin) extracellulära matrix protein | BQ175871 | 1442613_at | 0,189956563 | 9.41195E-06 | 0,861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestin 3, retinal | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3,944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN cDNA A330050F15 gen | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0,000119342 | 0,660282035 | 2.47342E-05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0,194404608 | 4.08641E-07 | 0,918742591 | 0,022545297 | ||
| calbindin-28K | BB246032 | 1417504_at | 0,196381321 | 2.24182E-05 | 0,619305124 | 3.6222E-06 | ||
| gastrin releasing peptide | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2,752845903 | 5.72954E-07 | ||
| sortilin-relaterade VPS10 domän som innehåller receptorn 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | 0,029733649 | ||
| dopamin-receptorn D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1,815881979 | 0,000516498 | ||
| proprotein convertase subtilisin / Kexin typ 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0,210528027 | 7.83039E-05 | 0,574126078 | 9.15496E-05 | ||
| interleukin 1-receptorn, typ I | NM_008362 | 1448950_at | 0,210572243 | 9.64524E-06 | 0,241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
Djurförsök har utförts i enlighet med National Institute of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur, och godkändes av djurens skötsel och användning kommittén vid Fujita Health University.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Yoko Nabeshima vid Kyoto University för sin undervisning på dissekering tekniken och Ms Aki Miyakawa vid Fujita Health University för hennes stöd till film. Detta arbete stöddes av Programmet för främjande av grundläggande studier inom vårdvetenskap av National Institute of Biomedical Innovation, en Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning på prioriterade områden, integrativ Brain Research (Shien) - från MEXT i Japan, och genom en Grant-i-Stöd från krönet av Japan Science and Technology Agency.
References
- Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
- Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
- Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
- Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
- Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press Inc.. San Diego. (1997).
