Summary
Bu videoya kaydedilmiş protokol stereomicroscope altında erişkin fareden dentat girus kaldırılması için diseksiyon tekniği gösterildi.
Abstract
Hipokampus, beynin bellek işleme ve öğrenme önemli fonksiyonel rolü, olağanüstü nöronal hücre plastisite ve katılımının epilepsi, nörodejeneratif hastalıklar ve psikiyatrik bozukluklar nedeniyle en çok araştırılan alanlardan biridir. Hipokampus, farklı bölgelerde oluşur; özellikle granül nöronlar, özellikle piramidal nöronlar oluşur Ammon boynuzu, ve iki bölge oluşur dentat girus, hem anatomik ve fonksiyonel devreleri ile bağlıdır. Birçok farklı mRNA'ların ve proteinler seçici dentat girus ifade ve dentat girus yetişkin nöron bir site olduğunu, sürekli yeni nöron yetişkin dentat girus oluşturulur. Dentat girus spesifik mRNA ve protein ifade araştırmak için, lazer yakalama mikrodiseksiyon sıklıkla kullanılmaktadır. Bu yöntem, özel aparatlar ve karmaşık işlemleri için ihtiyacınız olan, ancak bazı sınırlamalar vardır. Bu videoya kaydedilmiş protokol, stereomicroscope altında erişkin fareden dentat girus kaldırmak için bir diseksiyon tekniği göstermektedir. Bu tekniği kullanılarak hazırlanan dentat girus örnekleri, transcriptomic, proteomik ve hücre biyolojisi analizleri de dahil olmak üzere herhangi bir tahlil için uygundur. Disseke doku gerçek zamanlı dentat girus spesifik genlerin PCR, triptofan 2,3-dioxygenase (TDO2) ve desmoplakin (DSP) ve Ammon boynuzu zenginleştirilmiş genler, Meis ilgili gen 1b (Mrg1b yaparak dentat girus olduğunu doğruladı ) ve TYRO3 protein tirozin kinaz 3 (Tyro3). Mrg1b ve Tyro3 Ammon boynuzu örnekleri dışında, daha düşük düzeylerde iken, dentat girus örneklerinde TDO2 ve DSP mRNA ifadeleri, tabii ki daha yüksek seviyelerde tespit edildi. Bu yöntemin avantajı göstermek için, biz bütün hipokampus ve dentat girus örnekleri kullanarak DNA mikroarray analizi yapıldı. TDO2 ve DSP mRNA alpha-CaMKII + / tüm hipokampus, dentat girus seçici olarak ifade edilir, fareler, sırasıyla 0.037 ve wild-tip fareler ile karşılaştırıldığında 0.10 kat değişiklikler sergiledi. Izole dentat girus, ancak, bu ifadeleri daha büyük bir hassasiyet ile tespit edilebilir dentat girus bu gen ekspresyon değişiklikleri gösteren, 0.011 ve yabani tip farelerin göre 0.021 kat değişiklikler sergilenmektedir. Birlikte ele alındığında, bu uygun ve doğru diseksiyon tekniği güvenilir dentat girus odaklanmış çalışmaları için kullanılacak.
Protocol
Hipokampal dentat girus diseksiyonu
- Derin bir anestezi fare, kafatası dikkatlice beyni incelemek ve buz fosfat tamponlu salin (PBS) içine yerleştirin.
- Buz gibi soğuk PBS içeren bir Petri kabındaki beyin, beyin cerrahi bir bıçak kullanarak uzunlamasına fissür boyunca kesme ve lambda posterior bölgeler (orta beyin, arka beyin ve beyincik) kesti.
- Serebral hemisferin medial yüzü yukarı bakacak ve forseps kullanarak, dikkatli bir diseksiyon mikroskobu altında diensefalon (talamus ve hipotalamus) çıkarın. Bu dentat girus görünüm için sağlayarak, hipokampus, medial tarafında gösterecektir. Dentat girus aralarındaki boşluklar Ammon boynuzu ayırt. Hipokampus yaralanma veya çevresini, dentat girus izole etmek için daha zor hale getirecektir.
- Dentat girus dentat girus ve Ammon Kullanıcı boynuzu sınırları; Şekil 1'de her tarafında içine bir keskin iğne-ucu (örneğin, 27-ölçer iğne) takın, ve izole etmek için hipokampüsün septo-zamansal ekseni boyunca yüzeysel iğneler slayt dentat girus.
- Bir iğne veya forseps kullanarak izole dentat girus Pick up ve örnek bir tüp içine koyun. Böylece elde dentat girus doku örneği hemen her tayini için kullanılan ya da daha sonra kullanmak üzere derin dondurucuda saklanabilir.
- Aynı yöntemi kullanarak diğer serebral hemisferin dentat girus ayırın.
Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR
Dentat girus, yukarıda belirtilen yöntem ve kalan hipokampüs Ammon boynuzu, wild-tip farelerden alınan örnek olarak diseke edildi kullanılarak izole edilmiştir. Dentat girus ve daha önce 1 açıklandığı gibi Ammon boynuz örnekleri beta-aktin, TDO2, DSP, Mrg1b ve Tyro3 Real-time PCR ile yapıldı. Astarlar 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG ve 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC Tyro3 Mrg1b ve GCCTCCAAATTGCCCGTCA ve 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA için kullanılmıştır.
Mikroarray analizi
(- Fareler alpha-CaMKII + /) daha önce 1 açıklanan Mikroarray deneyler erkek wild-tip farelerden ve kalsiyum / kalmodulin-bağımlı protein kinaz II alfa-izoformu için heterozigot farelerde ile yapıldı. Kısaca, yabani tip ve mutant farelerin tüm hipokampus ve dentat girus izole RNA Fare Genom 430 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA) ile melezleşmiştir, ve her GeneChip Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (GCS3000) tarafından taranan . GeneChip analiz Mikroarray Analizi Suite sürümü 5.0 ile yapıldı.
Discussion
Dentat girus hipokampal formasyon 2,3 hacmi yaklaşık% 25 -% 30 kaplar . Bu eşsiz bir hücre kompozisyon ve çeşitli beyin fonksiyonlarında önemli roller oynamaktadır. Bu nedenle, dentat girus izole teknikleri özellikle bu bölgede meydana gelen olayları analiz etmek için yararlıdır.
Burada, yetişkin fare hipokampus dentat girus verimli bir şekilde incelemek için bir prosedür gösterilmiş ve tekniği hassas doğruladı. İlk olarak, histolojik çalışma dentat girus, diğer bölgelere göre kontaminasyon (Şekil 1) olmadan, saf bir dentat girus örnek hazırlanmış olabilir belirten ayrılmış olduğunu ortaya çıkardı.
İkincisi, disseke doku dentat girus özel genler, TDO2 ve DSP ve Ammon boynuzu zenginleştirilmiş genler, Mrg1b ve Tyro3 4 (Şekil 2) gerçek-zamanlı PCR yaparak dentat girus olduğunu doğruladı. TDO2, mRNA ifadeleri (p = 0,000023; n üyesinin = 4 ve 4, sırasıyla) ve DSP (p = 0,0000030; n üyesinin = 4 ve 4,) dentat girus örnekleri, tabii ki daha yüksek seviyelerde tespit edildi ise Mrg1b (p = 0.000080; n = 4 ve 4, sırasıyla) ve Tyro3 (p = 0,00017; n = 4 ve 4), Ammon boynuzu örnekleri daha düşük seviyelerde. Beta-aktin ekspresyon düzeyleri (n = 4 ve 4, p = 0.11), bu örneklerin farklı değildi . Böylece, dentat girus gibi basit bir gerçek-zamanlı PCR deneyler yaparak doğru disseke olup olmadığı kontrol edebilir.
Bu diseksiyon yöntemi yararını değerlendirmek için, Üçüncü, dentat girus ile tüm hipokampus mRNA düzeyi karşılaştırıldı. Farelerde (sırasıyla n üyesinin = 18 ve 4,) mikroarray analizi için işlenmiş edildi ve tüm genlerin gol için, kat-- wild-tip (N = 9 ve 4, sırasıyla) ve alfa-CaMKII + / elde Tüm hipokampus ve dentat girus değişiklik yabani tip değer mutant değeri bölünmesi ile hesaplanır. Sonuçları, özellikle DSP ve TDO2 olarak dentat girus özel moleküllerin mRNA değişiklikler, dentat girus örnekleri duyarlılığı tüm hipokampal örnekleri (Tablo 1) göre 5 kat artış tespit edildi. Daha önce fareler sergi davranışları gibi çalışan bellek kusuru ve abartılı bir infradian ritim 1,5 gibi insan psikiyatrik bozukluklar ile ilgili alpha-CaMKII + / göstermiştir. Ayrıca, mutant farelerde dentat girus nöronlar morfolojik ve elektrofizyolojik özellikleri bu mutant farelerde nöron vadesi 1 geliştirmek için başarısız olduğunu belirten, bu normal kemirgenlerde olgunlaşmamış dentat girus nöronların şaşırtıcı bir benzerlik taşımaktadır. Olgunlaşmamış dentat girus ve down regüle DSP ifade ve alpha-CaMKII TDO2 mRNA + / - fareler DSP ve TDO2 dentat girus (Ohira et al olgun granül hücreleri belirteçleri olarak kullanılan olarak yapabilirsiniz bu bulgu ile tutarlı olan, yayınlanmamış. veri).
Birlikte ele alındığında, bu uygun ve doğru diseksiyon tekniği güvenilir dentat girus odaklanmış çalışmaları için kullanılacak. Bu yöntemi kullanarak elde dentat girus doku proteomik ve hücre biyolojisi analizleri de dahil olmak üzere iyi analiz diğer türleri için geçerli.
Şekil 1 histolojik çalışmada izole dentat girus doğrulanması. Dentat girus izole sonra beynin koronal bölümünde Nissl boyama (sol panel), işlenmiş ve fare beyin atlas6 uyarlanmış bir şema ile sol paneli (sağ panel) gösterilen bölümün yaklaşık olarak aynı seviyede temsil eder. Oklar iğne ucu ekleme yöne işaret etmektedir. Ölçeği bar, 1 mm.
Şekil 2, gerçek zamanlı PCR ile izole dentat girus doğrulanması . Dentat girus ve Ammon s boynuz dört wild-tip farelerden elde edilen gerçek zamanlı beta-aktin PCR TDO2, DSP, Mrg1b ve Tyro3 için işlendi. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak verilmiştir. İstatistiksel analiz için Student t testi kullanılmıştır ve p değerleri takip edilir: beta-aktin, p = 0.11; TDO2, p = 0,000023 (** 1); DSP, p = 0,0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3) ve Tyro3, p = 0,00017 (** 4).
Tablo 1. Tüm hipokampus ve dentat girus Mikroarray analizi Genler farklı alfa-CaMKII dentat girus ve bütün hipokampus ifade + / - farelerde, wild-tip farelerden tespit kat değişim hesaplanarak belirlendi . Fareler - Veri yabani tip ve alpha-CaMKII + / arasında Student t testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık için analiz edildi. Genler arasında p <0.05 olan ifade sergiledialpha-CaMKII + / dentat girus - wild-tip farelerden göre fareler, ilk 50 gen listelenmiştir. Dentat girus için numune sayısının tüm hipokampus oranla çok daha az olduğunu unutmayın. AffyID, Affymetrix prob tanımlayıcısı; CKII, alpha-CaMKII + / - farelerde; WT, wild-tip farelerden.
| Dentat girus (p <0.05) WT: n = 4, CKII + / -: n = 4 | Tüm hipokampus WT: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| Gen Başlığı | Genebank | AffyID | Katlama değişiklik | p değeri | Katlama değişiklik | p değeri | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | 0,011018913 | 7.02694E-06 | 0,037021003 | 1.86126E-13 | ||
| desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0,014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| triptofan 2,3-dioxygenase | AI098840 | 1419093_at | 0,020986484 | 5.23546E-09 | 0,101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0,075479901 | 1.05191E-08 | 0,234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0,079457767 | 1.40433E-07 | 0,177974715 | 3.9758E-12 | ||
| tirotropin hormonu salgılatıcı reseptör | M59811 | 1449571_at | 0,103105815 | 0,003093796 | 0,801412732 | 0,283994361 | ||
| ryanodine reseptör 1, iskelet kası | X83932 | 1427306_at | 0,104825517 | 3.38513E-07 | 0,650685017 | 0,000308462 | ||
| bilgisiz sarmal döngü sarmal 1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4,078815314 | 5.27E-11 | ||
| copine aile üyesi IX. | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1,797304153 | 0,000296375 | ||
| doublecortin-3 kinaz | BB326709 | 1436532_at | 0,109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| calpain 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0,111269769 | 8.07053E-06 | 0,370956608 | 2.04421E-14 | ||
| Yetişkin erkek korpus striatum cDNA, RIKEN tam uzunlukta zenginleştirilmiş kütüphane, klon: C030023B07 ürün: unclassifiable, tam uç sırası | BB357628 | 1460043_at | 0,118712341 | 6.16926E-07 | 0,682339204 | 2.33001E-06 | ||
| kolajen ve kalsiyum bağlayıcı EGF etki 1 | AV264768 | 1437385_at | 0,124043978 | 3.65669E-05 | 0,488394112 | 4.05538E-06 | ||
| amiloid beta (A4) prekürsör protein bağlama, aile, üye 2 bağlayıcı protein | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2,099164713 | 1.67047E-06 | ||
| Calbindin-28K | BB177770 | 1456934_at | 0,130255444 | 3.32186E-06 | 0,572605751 | 1.99157E-10 | ||
| Transkripsiyonu lokus | AV328597 | 1443322_at | 0,133290835 | 5.43583E-06 | 0,562767164 | 7.56544E-06 | ||
| nöropeptid Y reseptör Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0,135319609 | 0,000113407 | 0,781498474 | 0.00394504 | ||
| ras duyarlı element bağlayıcı protein 1 | BE197381 | 1428657_at | 0,138235114 | 7.93691E-07 | 0,651220705 | 2.94209E-05 | ||
| glial hücre hattı nörotrofik faktör aile reseptörü elde edilen alfa 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0,139062563 | 2.35371E-06 | 0,669544709 | 0,000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1,766018828 | 0,000250501 | ||
| RIKEN cDNA 1810010H24 gen | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| ryanodine reseptör 1, iskelet kası | BG793713 | 1457347_at | 0,151364292 | 3.35612E-05 | 0,503144617 | 4.32907E-05 | ||
| protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0,152671849 | 8.57783E-06 | 0,670714726 | 1.56309E-05 | ||
| cornichon homolog 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0,153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | 0,661055608 | ||
| harakiri, BCL2 etkileşen protein (sadece Bh3 etki alanı içerir) | BQ175572 | 1439854_at | 0,154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| karbonhidrat (9 N-acetylgalactosamine 4-0) sulfotransferase | AK017407 | 1431897_at | 0,155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | 0,215637733 | ||
| calpain 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0,160871988 | 1.07655E-05 | 0,477164757 | 1.33753E-11 | ||
| çinko parmak, CCHC etki alanı içeren 5 | BQ126004 | 1437355_at | 0,161812078 | 3.08262E-06 | 0,421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0,165129967 | 1.86362E-05 | 0,639733409 | 0,000729772 | ||
| spondin 1 (f-spondin), ekstrasellüler matriks proteini | BC020531 | 1451342_at | 0,168035879 | 6.67867E-07 | 0,821042412 | 0,023650765 | ||
| RIKEN cDNA A930035E12 gen | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1,470383201 | 0,104085454 | ||
| BB247294 RIKEN tam uzunlukta zenginleştirilmiş 7 gün, yenidoğan beyincik Mus musculus cDNA klonu A730018G18 3 'mRNA sırası. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1,968147585 | 0.00010636 | ||
| Ferm etki alanı içeren 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0,000345581 | 2,780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2,652516957 | 0,000206279 | |||
| Transkripsiyonu sekansları | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1,296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1 (f-spondin), ekstrasellüler matriks proteini | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | 0,836181248 | 0,001380141 | ||
| Calbindin-28K | BB246032 | 1448738_at | 0,180317904 | 1.35961E-05 | 0,647334052 | 4.12268E-09 | ||
| 1 Marcks gibi | AV110584 | 1437226_x_at | 0,186235935 | 1.47067E-06 | 0,499291387 | 2.34984E-08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0,187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0,282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0,188195795 | 0,000105295 | 0,915528892 | 0.35282097 | ||
| spondin 1 (f-spondin), ekstrasellüler matriks proteini | BQ175871 | 1442613_at | 0,189956563 | 9.41195E-06 | 0,861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestin 3, retina | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3,944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN cDNA A330050F15 gen | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0,000119342 | 0,660282035 | 2.47342E-05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0,194404608 | 4.08641E-07 | 0,918742591 | 0,022545297 | ||
| Calbindin-28K | BB246032 | 1417504_at | 0,196381321 | 2.24182E-05 | 0,619305124 | 3.6222E-06 | ||
| gastrin peptid serbest | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2,752845903 | 5.72954E-07 | ||
| sortilin ilgili VPS10 etki alanı reseptör 3 içeren | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | 0,029733649 | ||
| dopamin reseptör D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1,815881979 | 0,000516498 | ||
| proprotein konvertaz subtilisin / kexin tip 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0,210528027 | 7.83039E-05 | 0,574126078 | 9.15496E-05 | ||
| interlökin 1 reseptör, tip I | NM_008362 | 1448950_at | 0,210572243 | 9.64524E-06 | 0,241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
Hayvan deneyleri Ulusal Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi uyarınca yapılır ve Fujita Sağlık Üniversitesi'nde hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından kabul edildi.
Acknowledgments
Biz filme destek için diseksiyon tekniği ve Fujita Sağlık Üniversitesi Bayan Aki Miyakawa onu talimat Kyoto Üniversitesi Dr. Yoko Nabeshima teşekkür ederim. Japonya'da MEXT gelen, ve - Bu çalışma, Ulusal Biyomedikal Yenilik, Öncelik Alanları-Bütünleştirici Beyin Araştırmaları (SHIEN) Bilimsel Araştırma için Hibe Yardım Enstitüsü Sağlık Bilimleri Temel Araştırmalar Teşvik Programı tarafından desteklenmiştir. Hibe-Japonya Bilim ve Teknoloji Kurumu CREST-Aid.
References
- Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
- Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
- Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
- Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
- Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press Inc.. San Diego. (1997).
