Summary
Una técnica de disección para la eliminación de la circunvolución dentada de ratones adultos bajo un microscopio estereoscópico se demostró en este protocolo de vídeo grabado.
Abstract
El hipocampo es una de las áreas más estudiadas en el cerebro debido a su importante papel funcional en el procesamiento de la memoria y el aprendizaje, su notable plasticidad de las células neuronales, y su participación en la epilepsia, enfermedades neurodegenerativas y trastornos psiquiátricos. El hipocampo se compone de regiones distintas, la circunvolución dentada, que comprende principalmente las neuronas granulares, y asta de Ammon, que comprende principalmente las neuronas piramidales, y las dos regiones están conectados por ambos circuitos anatómicos y funcionales. Muchos diferentes mRNAs y las proteínas se expresan selectivamente en el giro dentado, y el giro dentado es un sitio de la neurogénesis adulta, es decir, las nuevas neuronas son generadas continuamente en el giro dentado adulto. Para investigar la expresión de ARNm y proteínas específicas para el giro dentado, láser captura microdissection se utiliza a menudo. Este método tiene algunas limitaciones, sin embargo, como la necesidad de aparatos especiales y complicados procedimientos de manejo. En este protocolo en vídeo, que muestran una técnica de disección para eliminar el giro dentado de ratón adulto bajo un microscopio estereoscópico. Muestras de giro dentado preparados con esta técnica son adecuados para cualquier ensayo, incluyendo proteómica transcriptómica, y la celda análisis biología. Se confirmó que el tejido disecado es el giro dentado mediante la realización de PCR en tiempo real de la circunvolución dentada de genes específicos, triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO2) y desmoplaquina (DSP), y el asta de Ammon genes enriquecido, Meis relacionados 1b gen (Mrg1b ) y TYRO3 proteína tirosina quinasa 3 (Tyro3). Las expresiones de ARNm de TDO2 y DSP en el giro dentado muestras se detectaron en los niveles más altos, obviamente, mientras que Mrg1b y Tyro3 fueron los niveles más bajos, que en las muestras de cuerno de Ammon. Para demostrar la ventaja de este método, se realizó un análisis de microarrays de ADN con muestras de todo el hipocampo y el giro dentado. La expresión de mRNA TDO2 y DSP, que se expresan de forma selectiva en el giro dentado, en el hipocampo conjunto de la alfa-CaMKII + / - ratones, mostraron 0,037 y 0,10 veces los cambios en comparación con la de ratones de tipo salvaje, respectivamente. En el giro dentado aislado, sin embargo, estas expresiones expuestas 0,011 y 0,021 veces los cambios en comparación con la de ratones de tipo salvaje, lo que demuestra que los cambios de expresión génica en el giro dentado se pueden detectar con mayor sensibilidad. En conjunto, esta técnica de disección cómodo y preciso puede ser confiable para estudios se centraron en el giro dentado.
Protocol
La disección del giro dentado del hipocampo
- En un ratón profundamente anestesiados, cuidadosamente diseccionar el cerebro fuera del cráneo y lo coloca en helado de buffer fosfato salino (PBS).
- En una placa de Petri que contiene helado de PBS, cortar el cerebro a lo largo de la fisura longitudinal del cerebro utilizando un bisturí, y le cortó las regiones posteriores a la lambda (mesencéfalo, rombencéfalo, y el cerebelo).
- Coloque el lado medial del hemisferio cerebral y, con las pinzas, retire con cuidado el diencéfalo (tálamo e hipotálamo) bajo un microscopio de disección. Esto expondrá el lado medial del hipocampo, lo que permite la visualización de la circunvolución dentada. El giro dentado se distingue de asta de Ammon por los espacios entre ellos. La lesión del hipocampo o alrededores hará que sea más difícil aislar el giro dentado.
- Inserte un fuerte de punta de aguja (por ejemplo, de calibre 27 agujas) en cada lado de la circunvolución dentada (límites de la circunvolución dentada y asta de Ammon; Figura 1) y deslice las agujas superficialmente en el eje septo-temporal del hipocampo para aislar el giro dentado.
- Recoger el giro dentado aisladas con una aguja o con pinzas y colocarlo en un tubo de muestra. La muestra así obtenida dentado tejido giro se puede utilizar de inmediato para cualquier ensayo o almacenada en un congelador para su uso posterior.
- Aislar el giro dentado del otro hemisferio cerebral con el mismo método.
Cuantitativas PCR en tiempo real
El giro dentado se aisló utilizando el método antes mencionado y el hipocampo restantes se disecó a cabo como muestra el cuerno de Ammon de ratones de tipo salvaje. PCR en tiempo real de la beta-actina, TDO2, DSP, Mrg1b y Tyro3 se realizaron con el giro dentado y las muestras de Ammon cuerno como se describió anteriormente 1. 5'-5 'y CTGGCGAGATCACGATGACG AAGCTACGCTGTTGTCTAACC-fueron utilizados para Mrg1b y GCCTCCAAATTGCCCGTCA y 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA para Tyro3.
El análisis de microarrays
Experimentos de microarrays se realizaron con hombres ratones de tipo salvaje y ratones heterocigotos para la isoforma alfa de calcio / calmodulina dependiente de la proteína quinasa II (CaMKII-alfa + / - ratones) como se describió anteriormente 1. En pocas palabras, el ARN aislado de la totalidad o hipocampo circunvolución dentada de los ratones de tipo salvaje y mutante se hibridó con una matriz del genoma del ratón 430 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA), y cada GeneChip fue escaneada por un escáner Affymetrix GeneChip 3000 (GCS3000) . GeneChip análisis se realizó con el análisis de microarrays Suite versión 5.0.
Discussion
El giro dentado ocupa aproximadamente el 25% al 30% del volumen de la formación del hipocampo 2,3. Tiene una composición única célula y juega un papel crucial en funciones cerebrales diferentes. Por lo tanto, las técnicas para aislar el giro dentado son útiles para analizar los acontecimientos que se producen específicamente en esta región.
En este caso, hemos demostrado un procedimiento para analizar de manera eficiente el giro dentado del hipocampo de ratones adultos y confirmó la precisión de la técnica. En primer lugar, el estudio histológico reveló que el giro dentado se separaron sin la contaminación de otras regiones (Figura 1), lo que indica que una muestra pura giro dentado se pueden preparar.
En segundo lugar, confirmó que el tejido disecado es el giro dentado mediante la realización de PCR en tiempo real de dentado específico giro-genes, TDO2 y DSP, y los genes de Ammon cuerno enriquecido, Mrg1b y Tyro3 4 (Figura 2). Las expresiones de ARNm de TDO2 (p = 0,000023; n es = 4 y 4, respectivamente) y DSP (p = 0,0000030; n es = 4 y 4, respectivamente) en las muestras de giro dentado se detectaron en los niveles, obviamente, mayor, mientras que Mrg1b (p = 0.000080; n es = 4 y 4, respectivamente) y Tyro3 (p = 0,00017; = 4 y 4, respectivamente) n fueron los niveles más bajos, que en las muestras de cuerno de Ammon. Beta-actina niveles de expresión no fue diferente en estas muestras (p = 0,11, n = 4 y de 4, respectivamente). Por lo tanto, podríamos comprobar si el giro dentado se disecó con precisión a cabo mediante la realización de tan simples en tiempo real los experimentos de PCR.
En tercer lugar, para evaluar la utilidad de este método de disección, se comparó el nivel de expresión del ARNm del hipocampo conjunto con la del giro dentado. Hipocampo conjunto y el giro dentado obtenida de tipo salvaje (= 9 y 4, N, respectivamente) y la alfa-CaMKII + / - ratones (n = de 18 y 4, respectivamente) fueron procesados para análisis de microarrays, y para todos los genes anotados, el doble cambio se calcula dividiendo el valor de mutantes por el valor de tipo salvaje. Los resultados indicaron que los cambios en la expresión del ARNm, en especial de giro dentado específico de moléculas como el DSP y TDO2, se detectaron con un aumento de hasta 5 veces en la sensibilidad en las muestras de giro dentado en comparación con el conjunto de muestras del hipocampo (Tabla 1). Hemos demostrado que la alfa-CaMKII + / - ratones exhiben comportamientos humanos relacionados con trastornos psiquiátricos, tales como déficit de memoria de trabajo y un ritmo exagerado infradianos 1,5. Además, las características morfológicas y electrofisiológicas de las neuronas en el giro dentado ratones mutantes son sorprendentemente similares a los de las neuronas inmaduras giro dentado en los roedores normales, lo que indica que las neuronas en estos ratones mutantes no se desarrollan hasta la madurez 1. La expresión inmadura dentado giro y regulan a la baja de DSP y TDO2 mRNA en alpha-CaMKII + / - ratones son consistentes con la conclusión de que Dsp y TDO2 pueden ser utilizados como marcadores de células granulares maduras en el giro dentado (Ohira et al, inédito. de datos).
En conjunto, esta técnica de disección cómodo y preciso puede ser confiable para estudios se centraron en el giro dentado. Tejido giro dentado obtenidos mediante este método es aplicable a otros tipos de análisis, así, como los análisis de biología celular y la proteómica.
Figura 1. Verificación de la circunvolución dentada aislados por el estudio histológico. Una sección coronal del cerebro después de aislar giro dentado se procesó para la tinción de Nissl (izquierda), y un esquema adaptado del cerebro de ratón atlas6 representa aproximadamente el mismo nivel de la sección se muestra en el panel de la izquierda (panel derecho). Las flechas indican la dirección de la inserción de la aguja de punta. Barra de escala, de 1 mm.
Figura 2. Verificación de la circunvolución dentada aislado por PCR en tiempo real. La circunvolución dentada y el cuerno de Ammon s obtenidos a partir de cuatro ratones de tipo salvaje fueron procesados por PCR en tiempo real de la beta-actina, TDO2, DSP, Mrg1b y Tyro3. Los resultados se presentan como media ± SEM. Para el análisis estadístico, t de Student s fue empleado, y los valores de p seguir son: beta-actina, p = 0,11; TDO2, p = 0.000023 (** 1), DSP, p = 0.0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3), y Tyro3, p = 0,00017 (** 4).
Tabla 1. . Análisis de microarrays de todo el hipocampo y el giro dentado genes expresados diferencialmente en el giro dentado del hipocampo y el conjunto de la alfa-CaMKII + / - ratones se determinó mediante el cálculo de las veces el cambio de la detectada en ratones de tipo salvaje. Los datos fueron analizados para la significación estadística mediante la prueba t de Student s entre la naturaleza y tipo alpha-CaMKII + / - ratones. Entre los genes cuya expresión exhibida p <0,05 enla circunvolución dentada de alpha-CaMKII + / - ratones en comparación con la de ratones de tipo salvaje, los 50 genes se enumeran. Tenga en cuenta que el número de muestras para el giro dentado son mucho menores que las de todo el hipocampo. AffyID, Affymetrix sonda identificador; CKII, alpha-CaMKII + / - ratones, WT, ratones de tipo salvaje.
| Dentado giro (p <0,05) PESO: n = 4, CKII + / -: n = 4 | Hipocampo todo PESO: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| Gene Título | Bancos de germoplasma | AffyID | Veces el cambio | valor de p | Veces el cambio | valor de p | ||
| desmoplaquina | AV297961 | 1435494_s_at | 0,011018913 | 7.02694E-06 | 0,037021003 | 1.86126E-13 | ||
| desmoplaquina | AV297961 | 1435493_at | 0,014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| triptófano 2,3-dioxigenasa | AI098840 | 1419093_at | 0,020986484 | 5.23546E-09 | 0,101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0,075479901 | 1.05191E-08 | 0,234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0,079457767 | 1.40433E-07 | 0,177974715 | 3.9758E-12 | ||
| liberadora de tirotropina receptor de la hormona | M59811 | 1449571_at | 0,103105815 | 0,003093796 | 0,801412732 | 0,283994361 | ||
| rianodina un receptor, el músculo esquelético | X83932 | 1427306_at | 0,104825517 | 3.38513E-07 | 0,650685017 | 0,000308462 | ||
| hélice hélice nescient lazo 1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4,078815314 | 5.27E-11 | ||
| copine miembro de la familia IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1,797304153 | 0,000296375 | ||
| doublecortin-quinasa 3 | BB326709 | 1436532_at | 0,109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| calpaína 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0,111269769 | 8.07053E-06 | 0,370956608 | 2.04421E-14 | ||
| Estriado adulto de sexo masculino corpus cDNA, RIKEN de larga duración enriquecido la biblioteca, el clon: C030023B07 producto: secuencia inclasificable, inserte completa | BB357628 | 1460043_at | 0,118712341 | 6.16926E-07 | 0,682339204 | 2.33001E-06 | ||
| colágeno y calcio dominios EGF de unión 1 | AV264768 | 1437385_at | 0,124043978 | 3.65669E-05 | 0,488394112 | 4.05538E-06 | ||
| beta-amiloide (A4) precursor de la proteína de unión, de la familia A, miembro 2 de unión a proteínas | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2,099164713 | 1.67047E-06 | ||
| calbindina-28K | BB177770 | 1456934_at | 0,130255444 | 3.32186E-06 | 0,572605751 | 1.99157E-10 | ||
| Lugar transcribe | AV328597 | 1443322_at | 0,133290835 | 5.43583E-06 | 0,562767164 | 7.56544E-06 | ||
| neuropéptido Y receptor Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0,135319609 | 0,000113407 | 0,781498474 | 0.00394504 | ||
| ras de proteínas de unión un elemento de respuesta | BE197381 | 1428657_at | 0,138235114 | 7.93691E-07 | 0,651220705 | 2.94209E-05 | ||
| línea de células gliales derivadas del receptor neurotrófico familia del factor alfa 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0,139062563 | 2.35371E-06 | 0.669544709 | 0,000214146 | ||
| preproencefalina 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1,766018828 | 0,000250501 | ||
| RIKEN 1810010H24 gen de ADNc | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| rianodina un receptor, el músculo esquelético | BG793713 | 1457347_at | 0,151364292 | 3.35612E-05 | 0,503144617 | 4.32907E-05 | ||
| protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0,152671849 | 8.57783E-06 | 0,670714726 | 1.56309E-05 | ||
| cornichon homólogo 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0,153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | 0,661055608 | ||
| harakiri, BCL2 interacción de proteínas (contiene sólo BH3 de dominio) | BQ175572 | 1439854_at | 0,154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| hidratos de carbono (N-acetilgalactosamina 4-0) sulfotransferasa 9 | AK017407 | 1431897_at | 0,155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | 0,215637733 | ||
| calpaína 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0,160871988 | 1.07655E-05 | 0,477164757 | 1.33753E-11 | ||
| dedo de zinc, el dominio que contiene 5 CCHC | BQ126004 | 1437355_at | 0,161812078 | 3.08262E-06 | 0,421252632 | 0.01152969 | ||
| loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0,165129967 | 1.86362E-05 | 0,639733409 | 0,000729772 | ||
| Spondin 1, (f-Spondin) proteína de matriz extracelular | BC020531 | 1451342_at | 0,168035879 | 6.67867E-07 | 0,821042412 | 0,023650765 | ||
| RIKEN cDNA A930035E12 gen | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1,470383201 | 0,104085454 | ||
| BB247294 RIKEN de larga duración enriquecido, los 7 días cerebelo neonato Mus musculus clon cDNA A730018G18 3 ', secuencia del ARNm. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1,968147585 | 0.00010636 | ||
| FERM dominio que contiene 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0,000345581 | 2,780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2,652516957 | 0,000206279 | |||
| Secuencias transcritas | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1,296248831 | 0.22870031 | ||
| Spondin 1, (f-Spondin) proteína de matriz extracelular | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | 0,836181248 | 0,001380141 | ||
| calbindina-28K | BB246032 | 1448738_at | 0,180317904 | 1.35961E-05 | 0,647334052 | 4.12268E-09 | ||
| MARCKS-como un | AV110584 | 1437226_x_at | 0,186235935 | 1.47067E-06 | 0,499291387 | 2.34984E-08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0,187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0,282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0,188195795 | 0,000105295 | 0,915528892 | 0.35282097 | ||
| Spondin 1, (f-Spondin) proteína de matriz extracelular | BQ175871 | 1442613_at | 0,189956563 | 9.41195E-06 | 0,861033222 | 0.1394266 | ||
| arrestina 3, la retina | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3,944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN cDNA A330050F15 gen | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0,000119342 | 0,660282035 | 2.47342E-05 | ||
| contactin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0,194404608 | 4.08641E-07 | 0,918742591 | 0,022545297 | ||
| calbindina-28K | BB246032 | 1417504_at | 0,196381321 | 2.24182E-05 | 0,619305124 | 3.6222E-06 | ||
| gastrina péptido liberador de | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2,752845903 | 5.72954E-07 | ||
| sortilin relacionados VPS10 de dominio que contienen receptores de 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | 0,029733649 | ||
| los receptores de dopamina D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1,815881979 | 0,000516498 | ||
| convertasa subtilisina proproteína / Kexin tipo 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0,210528027 | 7.83039E-05 | 0,574126078 | 9.15496E-05 | ||
| IL-1 receptor tipo I | NM_008362 | 1448950_at | 0,210572243 | 9.64524E-06 | 0,241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de la Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y aprobado por el cuidado de los animales y el uso comisión de Salud de la Universidad Fujita.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Yoko Nabeshima en la Universidad de Kyoto para su instrucción en la técnica de disección y la Sra. Aki Miyakawa en Fujita de la Salud de la Universidad por su apoyo a la película. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Promoción de Estudios Fundamentales en Ciencias de la Salud del Instituto Nacional de la innovación biomédica, una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en las áreas prioritarias-Integrativa Investigación Cerebral (Shien) - de MEXT en Japón, y por un subsidio en ayuda de la cresta de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología.
References
- Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S., Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain. 1, 6-6 (2008).
- Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R., Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175-175 (1998).
- Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G., Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381-1381 (2003).
- Lein, E. S., Zhao, X., Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879-3879 (2004).
- Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20-20 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press Inc.. San Diego. (1997).
