Summary
Die technischen Aspekte der Durchführung LIPS (Luciferase Immunpräzipitation Systems) beschrieben sind. Das Gesamtkonzept beinhaltet Ausdruck chimären Gene Antigene fusioniert an Renilla Luziferase (RUC) in Säugerzellen. Crude Ruc-Antigen-Extrakte werden dann aufbereitet und ohne Reinigung eingesetzt in Immunpräzipitationsassays, um Antikörper zu quantifizieren.
Abstract
Technologien für umfassend zu verstehen und zu quantifizieren Antikörper-Profile auf Autoantigene und Infektionserreger können neue Einblicke in die Krankheitsmechanismen Ertrag und können neue Marker für Krankheiten aufzuklären mit unterschiedlichen klinischen Merkmalen substratify und besser zu verstehen Pathogenese. Wir haben eine sehr quantitative Methode aufgerufen Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS) zur Profilierung Patientenseren Antikörper-Antwort auf Autoantigene und Erreger-Antigenen mit einer Infektion assoziiert entwickelt. Im Gegensatz zu ELISAs, ist das hoch empfindliche Lippen leicht implementiert, um humoralen serologischen Antwort Profile verschiedener Antigene in einem universellen Format Umfrage und produziert dynamische Antikörper-Titer im Bereich von bis zu 6 log
Protocol
1. Schematische Übersicht:
Dieses Video zeigt die Schritte bei der Durchführung der LIPS-Test beteiligt. Antigene sind in COS1-Zellen als rekombinante Renilla-Luciferase (RUC)-Antigen Fusionen und Rohextrakte ausgedrückt erhalten und ohne Reinigung verwendet. Die LIPS-Test wird durch Inkubation crud e Ruc-Antigen-Extrakte mit Patientenseren in Mikrotitervertiefungen eingeleitet. Die Antikörper-Antigen-Gemisch wird dann zu einer 96-well Filterplatte mit Protein A / G Perlen IgG-Moleküle einzufangen übertragen. Nach dem Waschen der Filter-Platte mit dem Protein A / G Perlen, Antikörper gebunden Ruc-Antigen, das durch die Zugabe von Coelenterazin Substrat und Licht-Einheiten gemessen werden mit einem Luminometer gemessen.
TEIL 1: Transfektion von Plasmiden für die Herstellung von Renilla-Antigen-Fusionsproteine
Set-up: COS1 Zellen werden in DMEM-10% FCS mit Standard-Zellkultur-Protokolle kultiviert. Plasmide für Renilla Luziferase Fusionen wurden bereits 1 beschrieben. DNA für diese Plasmide wird unter Verwendung eines Midiprep Kit von Qiagen. Die Ausbeute sollte etwa 1 -3 mg werden. Messen Sie die DNA-Konzentration und speichern als 1000 ug / ml Stammlösung bei -20 ° C.
Vorgehensweise:
- Einen Tag vor der Transfektion aufgeteilt Cos-1 Zellen in neue 100 x 20 mm Gerichte bei ca. 2 x 10 6 pro Platte und bei 37 ° C.
- Am folgenden Tag sollte der Cos-1 Zellen werden 80-95% konfluent. Label 1,5 ml Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen für jedes Plasmid-DNA transfiziert werden. Lassen Sie die FuGENE-6 Transfektionsreagenz, welches bei 4 ° C gelagert, um sich aufzuwärmen, um Raumtemp.
- Add 94 ul der Opti-MEM Medien in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Als nächstes fügen Sie 6 ul FuGENE 6 zur Opti-MEM Medium ohne Berührung der Seitenwand.
- Inkubieren Sie die Mischung für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 1-2 pg (von 1mg/ml DNA stock) von Plasmid für Renilla Luziferase Antigen Fusionskonstrukt. Mix und dann inkubieren die Mischung für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Übertragen Sie die DNA-FuGENE 6-Opti-MEM-Lösung, um die Zellen durch Abtropfen es gleichmäßig in den Medien der COS1 Zellen.
TEIL 2: Die Ernte Renilla-Antigen-Fusions
- Zwei Tage nach der Transfektion werden die Cos-1 Zellen geerntet. Dies wird durch Entfernen des Mediums und dann Spülen der Zellen mit 6 ml PBS eingeleitet. Nach Dekantieren des PBS, Pipette entfernt restliche PBS aus dem Gewebe Kulturschale.
- Fügen Sie 1,4 ml kaltem Lysepuffer 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100, 50% Glycerin und Protease-Inhibitoren (2 Tabletten von kompletten miniprotease Inhibitor Cocktail pro 50 ml zusammen Lysepuffer). Ernten Sie die Zellen mit einer Zelle scrapper und schnell übertragen Hälfte des Lysats auf jeweils zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
- Ein Branson Sonifier 150 wird verwendet, um die Zellwände aufbrechen. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Zelllysat auf Eis und Impuls für 5 Sek., 5 Sek. und 5 Sek. mit Ultraschall-Einstellungen von 2, 2 bzw. 4.
- Centrifuge das Zelllysat bei 12.500 RPM für zwei 4 Minuten dreht sich bei 4 ° C. Nach dem ersten Spin, vorsichtig umdrehen den Rohren, die lose Trümmer von der Seitenwand des Rohres zu entfernen. Nach dem zweiten Spin Transfer vorsichtig den Überstand ab, ohne dass das Pellet aus den beiden Röhren ein neues Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
- Berechnen Sie die Licht-Einheiten (GVE) je pl Lysat. Zur Messung der LU, verdünnte 1 ul Lysat mit 8 ul PBS in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen. Direkt mit 100 ul 1X Coelenterazin Substrat, um die verdünnte Mischung und sofort messen Lumineszenz in der Röhre mit einem Rohr Luminometer (20/20 n Turner Scientific) mit einem 5 Sekunden gelesen.
- Bewahren Sie die Ruc-Antigen-Lysat bei -20 ° C für 1-2 Tage oder für einen längeren Zeitraum, wie oft in Aliquots bei -80 ° C.
TEIL 3: Vorbereiten eines Sera Masterplatte
- Machen Sie eine sera Master Platte hergestellt, indem zunächst 450 ul Puffer A (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100) in jede Vertiefung einer 96-Deep-Well Polypropylen Mikrotiterplatte . Bei diesem Schritt kann ein Farbstoff, Phenolrot, auch in Puffer A aufgenommen werden, (Endkonzentration liegt bei 0,2 pg / ml in Puffer A) als Tracer für die Überwachung künftiger sera Probenzugabe und andere Schritte der LIPS-Assay zu handeln, um.
- Als nächstes fügen Sie 50 ul Serum von jeder Probe, die verschiedenen Vertiefungen mit 450 ul Puffer A. Hinweis: Dies ist eine 1:10 Verdünnung der Seren in Puffer A. In der Regel Seren wird nicht auf die letzten beiden Vertiefungen der Master-Platte gegeben, weil Dies ist für den Puffer Rohlinge vorbehalten.
- Vor der Verwendung der Master-Platte, ist es ausgiebig geschüttelt (1-2 Stunden) auf einem Rotator-Plattform. Das Serum in die Master-Platte ist staBLE für mindestens 1 Monat (oder länger) bei 4 ° C, wenn sie richtig, um Verdunstung zu verhindern gespeichert.
- Wie unten beschrieben, bietet das Master-Platte 10 ul der verdünnten Seren wiederholt für die Profilierung der Seren gegen mehrere Antigene entfernt werden. Größere und kleinere Master-Platten können ebenfalls eingesetzt werden. Verschließen Sie die Platte gut mit Parafilm, wenn es nicht benutzt wird.
TEIL 4: LIPS-Test
- Polypropylen 96-flachen Mikrotiterplatten werden verwendet, um sera Test. Im ersten Schritt, dann werden 40 ul Puffer A zu jedem Well der 96-Well-Platte mit einem 8-Kanal Mikropipette.
- Nehmen Sie als nächstes 10 ul der verdünnten Seren (1 ul sera gleichwertig) von der Master-Platte und fügen Sie ihn direkt in jede Vertiefung der Arbeitsplatte mit einem 8-Kanal Mikropipette.
- Ein Master-Mix mit den Ruc-Antigen-Extrakt ist neben solchen, die 1 x 10 7 light units (LU) in 50 ul Puffer A in jede Vertiefung gegeben formuliert. Lower-Eingänge (nur 1 X 10 6) können ebenfalls verwendet werden, sondern führen zu einer geringeren dynamischen Bereichs. Machen Sie dieses Master-Gemisch und Pipette 50 ul Ruc-Antigen-Gemisch in jede Vertiefung.
- Die Platte auf einem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Während der Inkubation mit 5 ul einer 30% igen Suspension von Ultralink Protein A / G-Beads (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) in PBS auf den Boden jeder Vertiefung einer neuen 96-Loch-Filter HTS-Platte (Millipore, Bedford, MA) .
- Nach dem 1 Stunde Inkubation, übertragen Sie die 100 ul Ruc-Antigen-Antikörper-Reaktion Mischung auf 96-Well-Filter HTS-Platten, die das Protein A / G Kügelchen mit einem 8-Kanal Mikropipette.
- Inkubieren Sie die 96-Well-Filterplatte auf einem Schüttler für 1 weitere Stunde bei Raumtemperatur.
- Next waschen Sie den Filter Platte auf einem Vakuumkammer. Jedes der gut ist 8-mal mit 100 ul Puffer A gewaschen, gefolgt von zwei Mal mit 100 ul PBS. Dies kann manuell oder mit einem Roboter Pipettieren Workstation durchgeführt werden.
- Nach der letzten Waschung wird das Vakuum abgeschaltet. Entfernen Sie die Filterplatte und blot es trocken mit einem Stapel von Papiertüchern oder Filterpapier achten Sie darauf, Feuchtigkeit auf der Ober-und Unterseite der Platte zu entfernen.
TEIL 5: Messung der Lumineszenz und Datenanalyse
Set-up:
A Berthold LB 960 Centro Mikroplatten-Luminometer ist für die Bestimmung Lumineszenz in jede Vertiefung mit einer einzigen Düse verwendet. Nachdem die Maschine eingeschaltet ist, spülen Sie den Injektor mit destilliertem H 2 O mit dem Injektor Waschgang. Coelenterazin Substrat hergestellt unter Verwendung des Promega Renilla Substrat-Kit, wie vom Hersteller beschrieben. In der Regel 6 ml 1X Coelenterazin Substrat-Mix (dh 60 ul Coelenterazin Lager plus 6 ml 1X Puffer) ist für die Grundierung der Maschine vorbereitet und läuft eine volle 96-Well-Platte. Vor einer Analyse der Platte ist der Berthold LB 960 Centro Mikroplatten-Luminometer mit 1X Coelenterazin Substrat grundiert. Öffnen Sie ein Programm-Datei mit den Einstellungen für die Injektion des Substrates und das Lesen der Platte. Für diese Messungen wurden 50 ul Coelenterazin Substrat gespritzt wird, ist die Platte für 2 sec, durch ein 5 sec von Lumineszenz lesen gefolgt erschüttert.
- Obwohl die Platte Luminometer hat die Fähigkeit, die gesamte Platte zu lesen, kann eine partielle Lese von der Platte auch gewählt werden (unter der Lese-Menü) werden. Starten Sie das Programm, das von der Platte lesen initiiert.
- Nach dem Lauf entfernen Sie die Mikrotiterplatte Filterplatte umgehend Verschütten in das Luminometer zu verhindern. Exportieren Sie die Daten mit dem MikroWin Programm in eine Excel-Format für die Analyse generiert.
- Wir empfehlen die Beurteilung der Seren von zwei unabhängigen läuft. Die Daten werden dann gemittelt, um die LU-Titer-Werte für jede Probe zu erzeugen. Diese Werte können weiter angepasst, um den Puffer Rohlinge subtrahieren werden.
- Zusätzliche Datenanalyse wie die Bestimmung der Cut-off aus dem Mittelwert plus 3 oder 5 Standardabweichungen der Steuerung Werte berechnet werden können.
Discussion
LIPS erfordert nur minimale Assay-Optimierung und wegen seiner Einfachheit, qualitativ hochwertige Daten können in der Regel unter Verwendung LIPS in weniger als zwei Wochen für ein bestimmtes Antigen. Die zeitaufwendige Schritte sind das Klonen und die Erzeugung der entsprechenden Plasmid-Expressionsvektor mit der RUC-Antigen-Fusion. Sobald diese Plasmide erzeugt werden, können einzelne oder mehrere Antigene rasch mit LIPS getestet werden, wie oben beschrieben. Anzumerken ist, dass LIPS sehr vielseitig ist, dass Seren können auch in einem Rohr-Format oder alternativ auf einem Mikrotiter-Filterplatte mit Hilfe eines BIOMEK Roboter-Arbeitsstation 2 oder einem Teller Scheibe mit Vakuumfiltration getestet werden. Diese hoch skalierbare System ermöglicht die parallele LIPS Profilierung von einer Gruppe von Menschen Autoantigene 3 oder das gesamte Proteom eines Virus 4. Es ist wahrscheinlich, dass viele verschiedene Antikörper-Profile von LIPS generiert wird nützlich sein, für die Diagnostik 3-9, Entdeckung von Antigenen 9, nach dem Verlauf einer Behandlung 10, Impfstoff Überwachung und hat weitreichende Auswirkungen für bestimmte Erkrankungen und für die öffentliche Gesundheit im Allgemeinen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Interne Research Program der NIDCR unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
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