נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

Summary

ההיבטים הטכניים של ביצוע שפתיים (מערכות immunoprecipitation בלוציפראז) מתוארים. הגישה הכללית כרוכה לבטא גנים chimeric קידוד אנטיגנים התמזגו Renilla בלוציפראז (משטרת אלסטר) בתאי יונקים. גולמי משטרת אלסטר-אנטיגן תמציות מוכנים אז, ללא טיהור, המועסקים מבחני immunoprecipitation לכמת נוגדנים.

Abstract

טכנולוגיות מקיף הבנה וכימות פרופילים נוגדנים autoantigens וסוכני זיהומיות עשוי להניב תובנות חדשות על מנגנוני המחלה עשויה להבהיר סמנים חדשים substratify המחלה עם מאפיינים קליניים שונים להבין טוב יותר את הפתוגנזה. פיתחנו שיטה כמותית מאוד שנקרא מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים) עבור פרופיל החולה התגובות סרה נוגדנים autoantigens ו אנטיגנים הפתוגן הקשורות לזיהום. בניגוד ELISAs, השפתיים רגיש במיוחד מיושם בקלות סקר הלחות פרופילים בתגובה סרולוגיות ל אנטיגנים שונים בפורמט אוניברסלי ומייצרת כייל הנוגדנים דינמי טווחי עד יומן 6

Protocol

1. סכמטי סקירה:

סרט הווידאו הזה ממחיש את שלבים בביצוע assay השפתיים. אנטיגנים באים לידי ביטוי Cos1 התאים בלוציפראז Renilla רקומביננטי (משטרת אלסטר)-אנטיגן fusions, ותמציות גולמי מתקבלים בשימוש ללא טיהור. Assay השפתיים הוא שיזם דוגרים crud דואר משטרת אלסטר-אנטיגן עם תמציות סרה החולה microtiter בארות. התערובת נוגדן אנטיגן הוא הועבר לאחר מכן צלחת 96-לסנן היטב המכיל חלבון / חרוזים G ללכוד מולקולות IgG. לאחר שטיפת צלחת מסנן המכיל את חלבון נוגדן A / G חרוזים, מחויב משטרת אלסטר-אנטיגן נמדדת על ידי תוספת של מצע coelenterazine יחידות אור נמדדים עם luminometer.

חלק 1: transfection של פלסמידים לייצור Renilla-Antigen חלבונים Fusion

הקמה: Cos1 תאים בתרבית FCS DMEM-10% באמצעות תקן תרבות פרוטוקולים רקמות. פלסמידים עבור fusions בלוציפראז Renilla תוארו בעבר ^1. ה-DNA של פלסמידים אלה מוכן באמצעות ערכת Midiprep מ Qiagen. התשואה צריכה להיות בערך 1 מ"ג -3. למדוד את ריכוז הדנ"א לאחסן 1000 מיקרוגרם / מ"ל ​​מניות פתרון ב -20 ° C.

נוהל:

1. יום אחד לפני, לפצל transfection קוס-1 אל התאים חדש 100 x 20 מ"מ מנות בכ 2 X 10 ⁶ לכל צלחת לדגור על 37 ° C.
2. למחרת, קוס-1 תאים צריך להיות 80-95% ומחוברות. 1.5 תווית פוליפרופילן מ"ל microfuge צינורות עבור כל פלסמיד דנ"א להיות transfected. אפשר מגיב FuGENE-6 transfection, אשר מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, כדי לחמם את טמפ 'החדר.
3. הוסף 94 μl של Opti-ממ התקשורת צינור כל microfuge. לאחר מכן להוסיף 6 μl של FuGENE 6 עד בתקשורת Opti-ממ בלי לגעת בקיר צדדי.
4. דגירה את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הוספת 1-2 מיקרוגרם (ממלאי 1mg/ml DNA) של פלסמיד היתוך Renilla אנטיגן בלוציפראז לבנות. מערבבים ואז דגירה את התערובת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
6. מעבירים את פתרון ה-DNA FuGENE 6-Opti-ממ אל התאים באמצעות טפטוף לתוך זה שווה התקשורתי של Cos1 תאים.

חלק 2: מסיק Renilla-אנטיגן fusions

1. יומיים לאחר transfection, קוס-1 התאים נקצרים. זו שיזמה הוצאת התקשורת ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 6 מ"ל של PBS. לאחר decanting PBS, פיפטה משם כל PBS שיורית מצלחת בתרבית רקמה.
2. הוסף 1.4 מ"ל של חיץ תמוגה קר מורכב 50 מ"מ טריס, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 מ"מ MgCl _2, 1% Triton X-100, גליצרול 50% מעכבי פרוטאז (2 טבליות של קוקטייל מעכב להשלים miniprotease לכל 50 מ"ל של חיץ תמוגה). תאים קציר עם scrapper תא במהירות העברת מחצית lysate לכל אחד משני צינורות microfuge 1.5 מ"ל על הקרח.
3. Sonifier ברנסון 150 משמש כדי לשבור את התאים פתוחים. מניחים את הצינור microcentrifuge המכיל את תא lysate על קרח הדופק במשך 5 שניות, 5 שניות ו -5 שניות עם הגדרות sonication של 2, 2 ו -4, בהתאמה.
4. צנטריפוגה lysate התא 12,500 RPM עבור שני ספינים 4 דקות ב 4 ° C. לאחר הסיבוב הראשון, בעדינות להפוך את הצינורות כדי להסיר את פסולת מחוברת ברישול מ דפנות הצינור. אחרי הסיבוב השני, בזהירות העברת supernatant, מבלי לשבש את גלולה, משני צינורות לצינור microfuge חדש על הקרח.
5. חישוב יחידות אור (LU) לכל μl של lysate. כדי למדוד את LU, לדלל 1 μl של lysate עם 8 μl של PBS בצינור microfuge חדש. להוסיף ישירות 100 μl של המצע 1X coelenterazine לתערובת מדולל ומיד למדוד הארה בצינור באמצעות צינור luminometer (20/20 ⁿ טרנר מדעי) עם לקרוא 5 השני.
6. חנות lysate משטרת אלסטר-אנטיגן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים או לאחסן לתקופה ארוכה יותר של פעמים aliquots ב -80 ° C.

חלק 3: הכנת פלייט מאסטר סרה

1. הכן צלחת אב סרה על ידי הראשון להוסיף 450 μl של החיץ (50 מ"מ טריס, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 מ"מ MgCl _2, 1% Triton X-100) היטב בכל צלחת 96-עמוק היטב microtiter פוליפרופילן . בשלב זה, צבע אדום, פנול, יכול גם להיכלל במאגר (הריכוז הסופי הוא 0.2 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב חיץ) לשמש נותב לניטור בעתיד בנוסף סרה מדגם וצעדים אחרים של assay השפתיים.
2. לאחר מכן להוסיף 50 μl של סרה מכל מדגם של בארות שונות המכילות 450 μl של חיץ א הערה זו היא דילול 1:10 של סרה ב חיץ א בדרך כלל לא סרה הוא הוסיף שתי בארות האחרון של צלחת האב כי זו שמורה החסר חיץ.
3. לפני השימוש צלחת המאסטר, הוא מזועזע בהרחבה (1-2 שעות) על פלטפורמה rotator. סרום בצלחת המאסטר stable במשך חודש לפחות 1 (או יותר) בשעה 4 ° C, אם מאוחסן בצורה נכונה על מנת למנוע אידוי.
4. כפי שנראה בהמשך, זה אדון צלחת מספק 10 μl של סרה בדילול להסירו שוב ושוב פרופיל של סרה נגד אנטיגנים שונים. צלחות אמן גדול וקטן גם יכול להיות מועסק. חותם את הצלחת היטב עם Parafilm כאשר הוא אינו בשימוש.

חלק 4: assay שפתיים

1. פוליפרופילן 96-רדוד צלחות microtiter גם משמשים מבחן סרה. בשלב הראשון, להוסיף 40 μl של חיץ היטב בכל צלחת 96-היטב באמצעות micropipette ערוץ 8.
2. הבא לקחת 10 μl של סרה מדולל (1 μl המקבילה סרה) מהצלחת האב ולהוסיף אותה ישירות גם כל הצלחת לעבוד באמצעות micropipette ערוץ 8.
3. לערבב מאסטר המכיל את תמצית משטרת אלסטר-אנטיגן מנוסחת הבא כזה 1 X 10 ⁷ יחידות אור (LU) הוא הוסיף 50 μl של חיץ היטב כל אחד. תשומות התחתון (קצת כמו 1 X 10 ⁶⁾ יכול לשמש גם, אבל התוצאה בטווח דינמי נמוך יותר. הפוך תערובת אב פיפטה 50 μl של תערובת משטרת אלסטר-אנטיגן היטב כל אחד.
4. דגירה את הצלחת על שייקר רוטרי במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
5. במהלך הדגירה, מוסיפים 5 μl של השעיה של 30% של חלבון Ultralink A / G חרוזים (פירס ביוטכנולוגיה, Rockford, IL) ב-PBS לתחתית היטב כל אחד חדש 96 גם לסנן HTS צלחת (Millipore, בדפורד, מסצ'וסטס) .
6. לאחר דגירה 1 שעה, להעביר את התגובה 100 μl משטרת אלסטר-אנטיגן בתערובת נוגדנים ל 96 גם צלחות לסנן HTS המכיל את החלבון A / G חרוזים באמצעות micropipette ערוץ 8.
7. דגירה צלחת 96-לסנן היטב על שייקר רוטרי 1 שעה נוספת בטמפרטורת החדר.
8. לאחר מכן לשטוף את הצלחת לסנן על סעפת ואקום. גם כל שטף 8 פעמים עם 100 μl של הצפת, ואחריו שתי פעמים עם 100 μl של PBS. זה יכול להתבצע באופן ידני או עם תחנת עבודה pipetting רובוטית.
9. בעקבות לשטוף האחרון, הריק כבוי. הסר את צלחת לסנן כתם זה יבש באמצעות ערימה של מגבות נייר או נייר פילטר לוודא להסיר לחות על החלק העליון והתחתון של הצלחת.

פרק 5: מדידת הארה ניתוח נתונים

הקמה:

960 LB ברטולד Centro luminometer microplate משמש לקביעת הארה בכל היטב באמצעות מזרק אחד. ברגע שהמכונה פועלת, לשטוף את מזרק עם מזוקקים H ₂ O באמצעות מחזור לשטוף מזרק. המצע Coelenterazine מוכן באמצעות המצע Renilla Promega ערכת כפי שתואר על ידי היצרן. בדרך כלל 6 מ"ל של תערובת coelenterazine 1X המצע (כלומר 60 מניות coelenterazine μl פלוס 6 מ"ל של חיץ 1X) מוכן תחול את המכונה פועלת אחת צלחת 96-היטב. לפני ניתוח צלחת, 960 LB ברטולד Centro luminometer microplate ערוכה עם המצע 1X coelenterazine. פתיחת קובץ המכיל את תוכנית ההגדרה להזרקת המצע וקריאה את הצלחת. עבור מדידות אלה, 50 μl של המצע coelenterazine מוזרק, הצלחת הוא מזועזע למשך 2 שניות, ואחריו 5 שניות לקרוא של הארה.

1. למרות luminometer צלחת יש את היכולת לקרוא את הצלחת כולה, לקרוא חלקית של הצלחת יכול להיות גם שנבחר (תחת תפריט לקרוא). הפעל את התוכנית, אשר יוזם קריאה של הצלחת.
2. לאחר הריצה, להסיר את צלחת לסנן microtiter מיד כדי למנוע דליפה של luminometer. ייצוא נתונים שנוצר עם התוכנית MikroWin לתוך תבנית של Excel לניתוח.
3. אנו ממליצים הערכת סרה משני רץ עצמאית. נתונים ממוצעים אז כדי ליצור את הערכים titer LU עבור כל דגימה. ערכים אלה יכולים להמשיך להיות מותאם כדי להפחית את החסר חיץ.
4. ניתוח נתונים נוספים כגון קביעת הפסקת יכול להיות מחושב על ידי לקיחת הממוצע פלוס 3 או 5 סטיות תקן של ערכי שליטה.

Discussion

שפתיים דורש אופטימיזציה assay מינימלי, בשל הפשטות שלו, נתונים באיכות גבוהה בדרך כלל יכול להיות שנוצר באמצעות השפתיים תחת שבועיים אנטיגן נתון. השלבים זמן רב ביותר הם שיבוט ויצירת וקטור ביטוי הולם פלסמיד המכיל את היתוך משטרת אלסטר-אנטיגן. לאחר פלסמידים אלה נוצרות, אנטיגנים בודדות או מרובות, ניתן לבדוק במהירות עם השפתיים כפי שתואר לעיל. יש לציין כי הוא שפתיים צדדי למדי כך סרה יכול גם להיבחן במתכונת צינור או לחילופין על צלחת microtiter לסנן בעזרת תחנת עבודה BIOMEK רובוטית ² או מכונת כביסה צלחת עם סינון ואקום. מערכת זו ניתנת להרחבה מאפשרת השפתיים במקביל פרופיל של פאנל של autoantigens האדם ³ או ⁴ proteome שלם של וירוס. סביר להניח כי רבים פרופילים שונים נוגדן שנוצר על ידי שפתיים יהיה שימושי עבור ^3-9 האבחון, הגילוי אנטיגן ^9, בעקבות מהלך הטיפול ^10, ניטור החיסון יש השלכות רחבות על מדינות מחלה ספציפית לבריאות הציבור בכלל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiSpeed Plasmid Midi KIt	Qiagen	12643
100 x 20 mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	353003
Opti-MEM	Invitrogen	31985
FuGENE 6	Roche Group	1814443
Complete, Mini protease inhibitor cocktail	Roche Group	11836153001
Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate	Fisher Scientific	12-566-120	Deep well plate with lid and seal with Parafilm
Polypropylene microtiter plate	Fisher Scientific	12-566-120
HTS Filter plate	EMD Millipore	MSBVN1B50
Ultralink Immobilized Protein A/G	Pierce, Thermo Scientific	53133 (10ml)
Renilla Luciferase Assay System	Promega Corp.	E2820	For 2000 assays
Centro microplate luminometer	Berthold Technologies	LB 960