Summary
Gli aspetti tecnici di eseguire LIPS (Sistemi Immunoprecipitazione luciferasi) sono descritti. L'approccio generale prevede che esprimono i geni chimerici codifica antigeni fusi a Renilla luciferasi (Ruc) in cellule di mammifero. Greggio Ruc-antigene estratti vengono poi preparati e, senza purificazione, impiegati nei test di immunoprecipitazione per quantificare gli anticorpi.
Abstract
Tecnologie per la comprensione e la quantificazione completo profili anticorpi autoantigeni e agenti infettivi possono produrre nuove conoscenze sui meccanismi della malattia e può spiegare nuovi marcatori per substratify malattia con differenti caratteristiche cliniche e capire meglio la patogenesi. Abbiamo sviluppato un metodo altamente quantitativo chiamato Sistemi Immunoprecipitazione luciferasi (LIPS) per il profiling dei pazienti la risposta anticorpale sieri di autoantigeni e antigeni patogeni associati alle infezioni. A differenza di ELISA, le labbra molto sensibile può essere facilmente implementato per sondaggio umorale profili risposta sierologica di antigeni diversi in un formato universale e produce titolo anticorpale dinamica campi fino a 6 log
Protocol
1. Panoramica schematica:
Questo video mostra i passaggi necessari per eseguire il test labbra. Gli antigeni sono espressi in Cos1 cellule come luciferasi ricombinante Renilla (Ruc)-antigene fusioni, e gli estratti grezzi sono ottenuti e utilizzati senza purificazione. Il test LABBRA è avviata da incubando crud e Ruc-antigene estratti con sieri dei pazienti in pozzetti. L'anticorpo-antigene miscela viene poi trasferito su una piastra a 96 pozzetti filtro contenente la proteina A / G perline per catturare molecole di IgG. Dopo aver lavato la piastra filtro contenente la proteina Un anticorpo / G perline, legato Ruc-antigene è misurato con l'aggiunta di substrato coelenterazine e le unità di luce sono misurati con un luminometro.
PARTE 1: La trasfezione di plasmidi per la produzione di Renilla Antigen-proteine di fusione
Set-up: Cos1 le cellule sono coltivate in DMEM-10% FCS usando i protocolli standard di coltura dei tessuti. Plasmidi per Renilla fusioni luciferasi sono stati descritti in precedenza 1. DNA per questi plasmidi è preparata con un kit Midiprep da Qiagen. Il rendimento dovrebbe essere di circa 1 mg -3. Misurare la concentrazione di DNA e conservarlo come mcg 1000 / magazzino ml di soluzione a -20 ° C.
Procedimento:
- Un giorno prima Cos-1 transfezione, dividere le celle in nuovi piatti 100 x 20 mm a circa 2 x 10 6 per piastra e incubare a 37 ° C.
- Il giorno seguente, il Cos-1 le cellule dovrebbero essere 80-95% confluenti. Etichetta 1,5 ml tubi in polipropilene microcentrifuga per ogni DNA plasmidico da transfettate. Lasciare che il FuGENE-6 reagenti di trasfezione, che viene conservato a 4 ° C, per riscaldare a temperatura ambiente.
- Aggiungere 94 ml di Opti-MEM media per ogni provetta per microcentrifuga. Prossimo aggiungere 6 ml di FuGENE 6 al Opti-MEM multimediali senza toccare la parete laterale.
- Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1-2 mcg (da stock DNA 1mg/ml) di plasmide per Renilla fusione antigene luciferasi costruire. Miscelare e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire il DNA FuGENE soluzione 6-Opti-MEM per le cellule aggiungendo qualche goccia in modo uniforme nei media del Cos1 cellule.
PARTE 2: raccolta Renilla antigene-Fusioni
- Due giorni dopo la transfezione, il Cos-1 le cellule vengono raccolte. Questo è iniziata rimuovendo il materiale e poi risciacquare le cellule con 6 ml di PBS. Dopo la decantazione del PBS, pipetta via qualsiasi residuo di PBS dal piatto coltura di tessuti.
- Aggiungere 1,4 ml di tampone di lisi freddo composto da 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100, glicerolo 50% e inibitori della proteasi (2 compresse di cocktail completo inibitore miniprotease per 50 ml di tampone di lisi). Celle di raccolta con un scrapper cellula e trasferire rapidamente la metà del lisato a ciascuno dei due tubi da 1,5 ml microcentrifuga sul ghiaccio.
- Un Sonifier Branson 150 è utilizzata per rompere le cellule aperte. Collocare la provetta contenente il lisato cellulare su ghiaccio e di impulsi per 5 secondi, 5 secondi e 5 secondi con le impostazioni di sonicazione di 2, 2 e 4, rispettivamente.
- Centrifugare il lisato cellulare a 12.500 RPM per due 4 giri minuto a 4 ° C. Dopo il primo giro, capovolgere delicatamente i tubi per rimuovere i detriti liberamente attaccata dalla parete laterale del tubo. Dopo il secondo giro, trasferire con cautela il surnatante, senza disturbare il pellet, dai due tubi di una provetta per microcentrifuga nuovo sul ghiaccio.
- Calcolare i gruppi ottici (UBA) per ml di lisato. Per misurare la LU, diluire 1 ml di lisato con 8 ml di PBS in una provetta per microcentrifuga nuovo. Direttamente aggiungere 100 ml di 1X substrato coelenterazine alla miscela diluita e misurare immediatamente luminescenza nel tubo con un luminometro tubo (20/20 n Turner scientifico) con una lettura 5 secondi.
- Conservare la Ruc-antigene lisato a -20 ° C per 1-2 giorni o conservare per un periodo più lungo di volte in aliquote a -80 ° C.
PARTE 3: Preparazione di una piastra Sera master
- Fai una lastra sieri in primo luogo l'aggiunta di 450 ml di tampone A (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100) in ciascun pozzetto di una 96-profondo-pozzetti in polipropilene microtitolazione . A questo punto, un colorante, rosso fenolo, può anche essere incluso in un tampone A (concentrazione finale è di 0,2 mg / ml in tampone A) di agire come tracciante per il monitoraggio futuro l'aggiunta del campione sieri e altri passi del test labbra.
- Prossimo aggiungere 50 ml di siero di ogni campione nei pozzetti differenti contenente 450 ml di tampone A. Si noti che questa è una diluizione 1:10 del siero in tampone A. Tipicamente sieri non viene aggiunto gli ultimi due pozzetti della piastra maestro perché questo è riservato per i campi del buffer.
- Prima di utilizzare il piatto principale, è ampiamente scossa (1-2 ore) su una piattaforma dei rotatori. Il siero nella piastra principale è staBLE per almeno 1 mese (o più) a 4 ° C, se conservato correttamente per evitare l'evaporazione.
- Come descritto più avanti, questa piastra master fornisce 10 ml di siero diluito per essere ripetutamente rimosso per la profilatura dei sieri contro antigeni multipli. Piastre maestro grandi e piccole possono anche essere impiegati. Sigillare la piastra bene con Parafilm quando non viene utilizzato.
PARTE 4: analisi LIPS
- Polipropilene 96-superficiale micropiastre e sono usati per testare i sieri. Nella prima fase, aggiungere 40 ml di tampone A in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti utilizzando una micropipetta 8 canali.
- Prossimo prendere 10 ml di siero diluito (1 equivalente microlitri sieri) dalla piastra master e aggiungerlo direttamente a ciascun pozzetto della piastra di lavoro con un 8 micropipetta canale.
- Un master mix contenente i Ruc-antigene estratto è accanto formulata in modo tale che 1 x 10 7 gruppi ottici (LU) si aggiunge in 50 ml di tampone A per ciascun pozzetto. Basso input (anche solo di 1 X 10 6) può essere utilizzato anche, ma si ottiene una gamma dinamica più bassa. Rendono questa miscela maestro e pipettare 50 ml di Ruc-antigene miscela in ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra su un agitatore rotante per 1 ora a temperatura ambiente.
- Durante l'incubazione, aggiungere 5 ml di una sospensione al 30% di proteine Ultralink A / G perline (Pierce Biotecnologie, Rockford, IL) in PBS al fondo di ogni pozzetto di un nuovo 96 pozzetti filtro HTS piastra (Millipore, Bedford, MA) .
- Dopo l'incubazione 1 ora, trasferire il 100 ul Ruc miscela di reazione antigene-anticorpo a 96 e filtro piastre HTS contenente la proteina A / G con perline micropipetta a 8 canali.
- Incubare la piastra a 96 pozzetti filtro su un agitatore rotante per 1 ora in più a temperatura ambiente.
- Lavare quindi la piastra di filtro su un collettore di aspirazione. Ogni pozzetto viene lavato 8 volte con 100 ml di tampone A, seguito da due volte con 100 ml di PBS. Questa operazione può essere effettuata manualmente o con una workstation pipettaggio robotica.
- Dopo l'ultimo lavaggio, il vuoto è spento. Rimuovere la piastra di filtro e asciugare asciugare con una pila di tovaglioli di carta o carta da filtro avendo cura di rimuovere l'umidità nella parte superiore e inferiore della piastra.
PARTE 5: misura e analisi dei dati Luminescenza
Set-up:
Un Berthold LB 960 Centro micropiastre luminometro è utilizzato per determinare luminescenza in ciascun pozzetto utilizzando un singolo iniettore. Una volta che la macchina è accesa, sciacquare con acqua distillata l'iniettore H 2 O mediante il ciclo di lavaggio iniettori. Substrato Coelenterazine è preparato con il kit Renilla Promega substrato, come descritto dal produttore. Tipicamente 6 ml di mix 1X substrato coelenterazine (ovvero 60 magazzino coelenterazine microlitri oltre 6 ml di tampone 1X) è pronto per l'innesco della macchina e che esegue uno piatto pieno a 96 pozzetti. Prima di analizzare la piastra, il Berthold LB 960 Centro micropiastre luminometro è innescato con 1X substrato coelenterazine. Aprire un file di programma che contiene le impostazioni per l'iniezione del substrato e leggere la piastra. Per queste misurazioni, 50 ml di substrato coelenterazine viene iniettato, il piatto è scossa per 2 secondi, seguito da un 5 sec in lettura di luminescenza.
- Anche se il luminometro piastra ha la capacità di leggere l'intera piastra, una lettura parziale della piastra può essere selezionata (nel menu di lettura). Avviare il programma, che inizia la lettura della piastra.
- Dopo l'esecuzione, rimuovere la piastra microtiter filtro tempestivamente per evitare la fuoriuscita del luminometro. Esportare i dati generati con il programma MikroWin in un formato Excel per l'analisi.
- Si consiglia di valutare i sieri di due piste indipendenti. I dati vengono poi media per generare i valori titolo LU per ogni campione. Questi valori possono essere ulteriormente regolata per sottrarre gli spazi vuoti buffer.
- Ulteriori analisi dei dati, come la determinazione del taglio può essere calcolato prendendo la media più 3 o 5 deviazioni standard dei valori di controllo.
Discussion
LABBRA richiede l'ottimizzazione minimo dosaggio e, grazie alla sua semplicità, dati di alta qualità in genere può essere generato usando LIPS in meno di due settimane per un dato antigene. I passi più tempo sono la clonazione e generazione del vettore di espressione appropriato plasmide contenente il Ruc antigene-fusione. Una volta che questi plasmidi sono generati, antigeni singole o multiple possono essere rapidamente testato con LABBRA come descritto sopra. Va notato che le labbra è molto versatile, in modo tale che i sieri possono essere testati in un formato tubo o in alternativa su una piastra di microtitolazione filtro con l'ausilio di una workstation robotica Biomek 2 o una rondella piatto con filtrazione a vuoto. Questo sistema altamente scalabile permette di LABBRA parallelo profilazione di un panel di umano autoantigeni 3 o l'intero proteoma di un 4 virus. E 'probabile che molti profili diversi anticorpi generati dalla LABBRA sarà utile per la diagnostica 3-9, antigene scoperta 9, seguendo il corso di un trattamento di 10, il monitoraggio del vaccino e ha vaste implicazioni per stati patologici specifici e per la salute pubblica in generale.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca intramurale del NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
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