Summary
Los aspectos técnicos de la realización de los labios (Sistemas de luciferasa inmunoprecipitación) se describen. El enfoque general consiste en la expresión de genes quiméricos que codifican antígenos fusionados a Renilla luciferase (RUC) en células de mamíferos. Crudo Ruc-antígeno extractos son preparados y, sin purificación, empleados en ensayos de inmunoprecipitación para cuantificar anticuerpos.
Abstract
Tecnologías para la exhaustiva comprensión y cuantificación de perfiles de anticuerpos frente a autoantígenos y los agentes infecciosos pueden producir nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad y puede dilucidar los nuevos marcadores de la enfermedad substratify con diferentes características clínicas y comprender mejor la patogénesis. Hemos desarrollado un método altamente cuantitativa llamada luciferasa Sistemas de inmunoprecipitación (LIPS) para crear perfiles de los pacientes la respuesta de anticuerpos suero de autoantígenos y antígenos de patógenos asociados con la infección. A diferencia de las pruebas ELISA, los labios muy sensibles es fácil de implementar para estudiar los perfiles de respuesta serológica humoral a los antígenos diferentes en un formato universal y produce títulos de anticuerpos dinámica un alcance de hasta 6 log
Protocol
1. Esquemática general:
Este video muestra los pasos necesarios para realizar el ensayo LIPS. Antígenos se expresan en células COS1 como recombinante luciferasa Renilla (RUC) del antígeno-fusiones, y extractos crudos obtenidos y utilizados sin purificación. El ensayo LIPS se inicia mediante la incubación de porquería e-Ruc antígeno extractos con sueros de pacientes en pocillos de microtitulación. La mezcla de antígeno-anticuerpo se transfiere a una placa de 96 pozos de filtración que contienen la proteína A / G cuentas para capturar las moléculas de IgG. Después de lavar la placa de filtro que contiene la proteína A / anticuerpo G cuentas, con destino Ruc-antígeno se mide por la adición de sustrato coelenterazine y unidades de luz se miden con un luminómetro.
PARTE 1: La transfección de plásmidos para la producción de proteínas de fusión antígeno-Renilla
Set-up: COS1 células se cultivan en DMEM-FCS al 10% utilizando los protocolos estándar de cultivo de tejidos. Plásmidos de luciferasa Renilla fusiones se han descrito anteriormente 1. ADN de estos plásmidos se prepara utilizando un kit de Qiagen Midiprep. El rendimiento debe ser de aproximadamente 1 mg -3. Medir la concentración de ADN y almacena como un mg 1000 / ml de solución madre a -20 ° C.
Procedimiento:
- Un día antes de la transfección, dividir células COS-1 en los nuevos 100 x 20 mm platos en aproximadamente 2 x 10 6 por placa y se incuba a 37 ° C.
- Al día siguiente, la células COS-1 debe ser un 80-95% confluente. Etiqueta de 1,5 ml tubos de microcentrífuga de polipropileno para cada plásmido de ADN que se transfectadas. Permita que el reactivo de transfección FuGENE-6, que se conserva a 4 ° C, para calentar a temperatura ambiente.
- Añadir 94 l de Opti-MEM medios de comunicación a cada tubo de microcentrífuga. A continuación añadimos 6 l de FuGENE 6 a los medios de Opti-MEM sin tocar la pared lateral.
- Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 1.2 g (desde el almacén de ADN 1mg/ml) de plásmido para la fusión de antígeno Renilla luciferase construir. Mezcla y se incuba la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- La transferencia de la solución de ADN-FuGENE 6 Opti-MEM a las células por goteo de manera uniforme en los medios de comunicación de las células COS1.
PARTE 2: Recolección de antígeno Renilla-Fusions
- Dos días después de la transfección, las células COS-1 se cosechan. Este se inicia con la eliminación de los medios de comunicación y luego enjuagar las células con 6 ml de PBS. Después de la decantación de la PBS, la pipeta a la basura cualquier PBS residual de la placa de cultivo de tejidos.
- Añadir 1,4 ml de solución amortiguadora de lisis frío compuesto por 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100, 50% de glicerol y los inhibidores de la proteasa (2 comprimidos de cóctel completo inhibidor miniprotease por 50 ml de tampón de lisis). Las células de la cosecha con un raspador de células y rápida transferencia de la mitad de la lisado de cada uno de dos tubos de 1,5 ml de microcentrífuga en hielo.
- A Sonifier Branson 150 se utiliza para romper las celdas abiertas. Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene el lisado celular en el hielo y el pulso durante 5 segundos, 5 segundos y 5 segundos con la configuración de ultrasonidos de 2, 2 y 4, respectivamente.
- Centrifugar el lisado celular a 12.500 rpm durante dos vueltas 4 minutos a 4 ° C. Después de la primera vuelta, invertir suavemente los tubos para eliminar los restos poco adjunta de la pared lateral del tubo. Después de la segunda vuelta, transferir cuidadosamente el sobrenadante, sin alterar el sedimento, a partir de los dos tubos a un tubo de microcentrífuga nuevo en hielo.
- Calcular las unidades de luz (UGM) por l de lisado. Para medir la LU, diluir 1 l de lisado con 8 l de PBS en un tubo de microcentrífuga nuevo. Directamente añadir 100 ml de sustrato coelenterazine 1X a la mezcla diluida y de inmediato medidas de luminiscencia en el tubo con un tubo luminómetro (20/20 n Turner Científico) con una lectura de 5 segundos.
- Tienda el lisado Ruc-antígeno a -20 ° C durante 1-2 días o almacén para un período más largo de los tiempos en alícuotas a -80 ° C.
PARTE 3: Preparación de una placa Sera Maestro
- Hacer una placa maestra sueros añadiendo primero 450 l de tampón A (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100) a cada pocillo de una placa de polipropileno de 96 pozos profundos de microtitulación . En este paso, un colorante rojo, fenol, también se pueden incluir en un buffer (concentración final es de 0,2 mg / ml en tampón A) para actuar como un marcador para el monitoreo futura incorporación de la muestra de suero y otras medidas del ensayo LIPS.
- A continuación se añaden 50 l de suero de cada muestra a los diferentes pozos que contiene 450 l de tampón A. Nótese que esta es una dilución 1:10 de los sueros en buffer A. Por lo general los sueros no se agrega a los dos últimos pozos de la placa principal, ya esto está reservado para los espacios de amortiguación.
- Antes de utilizar la placa principal, que es ampliamente sacudida (1-2 horas) en una plataforma de los rotadores. El suero de la placa principal es estableble de al menos 1 mes (o más) a 4 ° C, si se almacena correctamente para evitar la evaporación.
- Como se describe más adelante, esta placa principal dispone de 10 l de suero diluido para ser eliminado debido a que en repetidas ocasiones el perfil de los sueros contra múltiples antígenos. Grandes y pequeñas placas maestras también pueden ser empleados. Sellar la placa con Parafilm y cuando no se está utilizando.
PARTE 4: ensayo LIPS
- Polipropileno de 96 placas de microtitulación poco profundas y se utilizan para los sueros. En el primer paso, agregar 40 ml de un buffer a cada pocillo de la placa de 96 pocillos utilizando una micropipeta de 8 canales.
- A continuación, tomar 10 l de suero diluido (1 l equivalente sueros) de la placa principal y añadir directamente a cada pocillo de la placa de trabajo utilizando una micropipeta de 8 canales.
- Una mezcla maestra que contiene el extracto Ruc-antígeno está al lado de formularse de manera que 1 X 10 7 unidades de luz (LU) se añade en 50 l de tampón A a cada pocillo. Menos insumos (tan poco como 1 x 10 6) también se puede utilizar, pero el resultado en un menor rango dinámico. Hacer esta mezcla principal y pipeta de 50 l de mezcla de Ruc-antígeno en cada pocillo.
- Se incuba la placa en un agitador rotatorio durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Durante la incubación, añadir 5 l de una suspensión del 30% de proteína Ultralink A / G cuentas (Pierce Biotecnología, Rockford, IL) en PBS en el fondo de cada pocillo de una nueva placa de filtro de 96 HTS (Millipore, Bedford, MA) .
- Después de la incubación de 1 hora, la transferencia de los 100 l Ruc antígeno-anticuerpo mezcla de reacción a 96 y placas de filtro HTS que contienen la proteína A / G a través de cuentas de una micropipeta de 8 canales.
- Se incuba la placa de 96 pozos de filtro en un agitador rotatorio durante 1 hora más a temperatura ambiente.
- A continuación se lava la placa de filtro en un colector de vacío. Cada pocillo se lava 8 veces con 100 l de tampón A, seguido por dos veces con 100 l de PBS. Esto se puede realizar manualmente o con una estación de trabajo pipeteo robótica.
- Tras el último lavado, el vacío está apagado. Retire la placa del filtro y séquelo con una pila de toallas de papel o papel de filtro y asegúrese de eliminar la humedad en la parte superior e inferior de la placa.
PARTE 5: análisis de medición de luminiscencia y datos
Set-up:
A Berthold LB 960 Centro microplaca luminómetro se utiliza para determinar la luminosidad en cada pocillo utilizando un solo inyector. Una vez que la máquina está encendida, lavar los inyectores con agua destilada H 2 O con el ciclo de lavado del inyector. Coelenterazine sustrato es preparado con el kit de Promega Renilla sustrato como se describe por el fabricante. Generalmente de 6 ml de la mezcla de sustrato coelenterazine 1X (es decir, 60 acciones coelenterazine l más 6 ml de 1X buffer) se prepara para el cebado de la máquina en funcionamiento un plato lleno de 96 pozos. Antes de analizar la placa, el LB Berthold 960 Centro microplaca luminómetro se ceba con sustrato coelenterazine 1X. Abrir un archivo de programa que contiene la configuración de la inyección del sustrato y la lectura de la placa. En estas mediciones, 50 l de sustrato coelenterazine se inyecta, la placa se agita durante 2 segundos, seguido de un 5 seg de lectura de luminiscencia.
- Aunque el luminómetro placa tiene la capacidad de leer toda la placa, una lectura parcial de la placa también puede ser seleccionado (en el menú de lectura). Iniciar el programa, que inicia la lectura de la placa.
- Después de correr, quitar la placa del filtro de microtitulación con prontitud para evitar derrames en el luminómetro. Exportar los datos generados con el programa MikroWin en un formato Excel para su análisis.
- Se recomienda la evaluación de los sueros de dos carreras independientes. Los datos se promedian para generar los valores título de LU para cada muestra. Estos valores aún se puede ajustar para restar los espacios de amortiguación.
- Análisis de datos adicionales, tales como la determinación de la corte se puede calcular tomando la media más 3 o 5 desviaciones estándar de los valores de control.
Discussion
LABIOS requiere la optimización del ensayo mínimo y, debido a su simplicidad, los datos de alta calidad por lo general se pueden generar con los labios en menos de dos semanas de cualquier antígeno dado. Los pasos que más tiempo se encuentra la clonación y la generación del vector de expresión apropiado plásmido que contenía la fusión Ruc-antígeno. Una vez que estos plásmidos se generan, los antígenos individuales o múltiples puede ser rápidamente probado con los labios como se describió anteriormente. Cabe señalar que los labios es muy versátiles, que el suero puede ser probado en un formato de tubo, o bien en una placa de microtitulación de filtro con la ayuda de una estación de trabajo robotizada Biomek 2 o un lavador de placas de filtración al vacío. Este sistema altamente escalable permite a los labios paralelos perfil de un grupo de humanos autoantígenos 3 o el proteoma completo de un 4 virus. Es probable que muchos perfiles diferentes de anticuerpos generados por los labios serán de utilidad para el diagnóstico de 3-9, antígeno de descubrimiento 9, siguiendo el curso de un tratamiento de 10, el control de vacunas y tiene amplias implicaciones para los estados específicos de la enfermedad y la salud pública en general.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
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