Summary
موصوفة في الجوانب التقنية لأداء الشفاه (نظم Luciferase مناعي). النهج الشامل ينطوي على التعبير عن الجينات خيالية ترميز مستضدات تنصهر لluciferase Renilla (شرطة ألستر الملكية) في خلايا الثدييات. مستعدون الخام RUC مستضد مقتطفات ثم ، دون تنقية ، والعاملين في المقايسات مناعي لقياس الأجسام المضادة.
Abstract
قد التقنيات لفهم شامل وقياس الأجسام المضادة لمحات autoantigens والعوامل المعدية العائد رؤى جديدة في آليات المرض ، ويمكن توضيح معالم جديدة لsubstratify المرض بمظاهر سريرية مختلفة ، وفهم أفضل المرضية. طورنا طريقة كمية عالية تسمى أنظمة مناعي Luciferase (الشفاه) لالتنميط المريض استجابات الأجسام المضادة لالأمصال والمضادات autoantigens الممرض المرتبطة بالعدوى. خلافا ELISAs ، تنفذ بسهولة LIPS حساسة للغاية لدراسة ملامح الاستجابة الخلطية المصلية لمستضدات مختلفة في شكل شامل وتنتج دينامية عيار الأضداد يصل مداها إلى 6 السجل
Protocol
1. التخطيطي لمحة عامة :
هذا الفيديو يوضح الخطوات المتبعة في أداء مقايسة الشفاه. يتم التعبير عن مستضدات الخلايا كما في Cos1 المؤتلف luciferase Renilla (RUC) مستضد اندماج ، ومقتطفات ويتم الحصول على الخام واستخدامها دون تنقية. يبدأ الفحص الشفاه التي يحتضنها CRUD ه RUC مستضد مقتطفات الأمصال مع المريض في الآبار microtiter. ثم يتم نقل الخليط الضد مستضد لوحة 96 - جيدا تصفية يحتوي على بروتين A / G الخرز لالتقاط جزيئات مفتش الحكومة. بعد الغسيل لوحة تحتوي على فلتر للبروتين يتم قياس الأجسام المضادة A / G الخرز ، وملزمة يقاس RUC مستضد عن طريق إضافة وحدات الركيزة coelenterazine الخفيفة مع luminometer.
الجزء 1 : ترنسفكأيشن من البلازميدات لانتاج البروتينات الانصهار Renilla مستضد
انشاء : يتم تربيتها في الخلايا Cos1 DMEM FCS - 10 ٪ باستخدام معيار بروتوكولات زراعة الأنسجة. وقد وصفت البلازميدات للاندماج luciferase Renilla سابقا 1. مستعدة الحمض النووي لهذه البلازميدات استخدام عدة Midiprep من Qiagen. وينبغي أن تكون الغلة ما يقرب من 1 ملغ -3. قياس تركيز الحمض النووي وتخزينها باعتبارها ميكروغرام 1000 / مل حل السهم عند -20 درجة مئوية.
الإجراء :
- قبل يوم واحد ترنسفكأيشن ، وتقسيم كوس - 1 الخلايا الجديدة الى 100 × 20 ملم على أطباق حوالي 2 6 10 X في لوحة واحتضان عند 37 درجة مئوية.
- في اليوم التالي ، ينبغي لل- 1 كوس الخلايا تكون 80-95 ٪ متموجة. أن تكون التسمية transfected أنابيب البولي بروبلين 1.5 مل microfuge لكل DNA البلازميد. السماح للكاشف ترنسفكأيشن FuGENE - 6 ، والتي يتم تخزينها في 4 درجات مئوية ، في عملية الاحماء لدرجة حرارة الغرفة.
- إضافة ميكرولتر من 94 OPTI - MEM وسائل الإعلام إلى كل أنبوب microfuge. إضافة القادم 6 ميكرولتر من FuGENE 6 إلى وسائل الإعلام OPTI - MEM دون لمس الجدار الجانبي.
- احتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 1-2 ميكروغرام (من المخزون 1mg/ml DNA) من البلازميد لRenilla الانصهار مستضد luciferase بناء. المزيج ثم احتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل الحل 6 OPTI - MEM FuGENE الحمض النووي للخلايا التي تتساقط عليه بالتساوي في وسائل الإعلام من الخلايا Cos1.
الجزء 2 : حصاد Renilla مستضد الإنشطار
- بعد يومين من ترنسفكأيشن ، يتم حصاد كوس - 1 الخلايا. يبدأ ذلك من خلال وسائل الإعلام وإزالة ثم شطف الخلايا مع 6 مل من برنامج تلفزيوني. بعد الصب في برنامج تلفزيوني ، ماصة بعيدا أي برنامج تلفزيوني المتبقية من النسيج صحن الثقافة.
- إضافة 1.4 مل من تحلل الباردة عازلة مكونة من تريس 50 ملم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 5 ملي MgCl 2 ، 1 ٪ تريتون X - 100 ، 50 ٪ الجلسرين ومثبطات الأنزيم البروتيني (2 حبة من إكمال miniprotease كوكتيل المانع لكل 50 مل من تحلل العازلة). حصاد الخلايا مع المزيل الخلية ونقل بسرعة نصف lysate لكل اثنين من 1.5 مل أنابيب microfuge على الجليد.
- ويستخدم Sonifier برانسون 150 إلى كسر خلايا مفتوحة. وضع أنبوب microcentrifuge تحتوي على lysate الخلية على الجليد والنبض لمدة 5 ثوانى ثوانى 5 و 5 ثوانى مع إعدادات صوتنة من 2 و 2 و 4 على التوالي.
- أجهزة الطرد المركزي في lysate الخلية في 12500 دورة في الدقيقة لمدة 4 دقائق يدور في 4 درجات مئوية. وبعد أن تدور الأولى ، عكس بلطف الأنابيب لإزالة الحطام فضفاضة يعلق من جدار الأنبوب. بعد زيادة ونقصان الثانية ، بعناية نقل طاف ، دون الإخلال بيليه ، من أنابيب اثنين إلى أنبوب microfuge جديدة على الجليد.
- حساب الوحدات الخفيفة (LU) لكل ميكرولتر من lysate. لقياس LU ، تمييع 1 ميكرولتر من lysate مع 8 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب microfuge جديدة. مباشرة إضافة 100 ميكرولتر من الركيزة coelenterazine 1X إلى خليط المخفف وقياس فورا التلألؤ في الأنبوب باستخدام أنبوب luminometer (20/20 ن تيرنر العلمي) مع 5 قراءة الثانية.
- تخزين lysate RUC مستضد في -20 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام أو تخزينها لفترة أطول من المرات في aliquots في -80 درجة مئوية.
الجزء 3 : إعداد اللوحة الرئيسية سيرا
- جعل لوحة رئيسية من جانب أول الأمصال مضيفا ميكرولتر من 450 ألف إلى المخزن (50 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 100 مم كلوريد الصوديوم ، 5 ملي MgCl 2 ، 1 ٪ تريتون X - 100) كل بئر من لوحة البولي بروبلين microtiter 96 في آبار عميقة . في هذه الخطوة ، يمكن أيضا صبغة ، الفينول الأحمر ، أن تدرج في المخزن A (التركيز النهائي هو 0.2 ميكروغرام / مل في مخزن A) ليكون بمثابة تتبع لرصد المستقبل بالإضافة إلى عينة الأمصال وغيرها من الخطوات للمقايسة الشفاه.
- إضافة المقبل 50 ميكرولتر الأمصال من كل عينة من آبار مختلفة تحتوي على 450 ألف العازلة ميكرولتر من ملاحظة هذا هو تمييع 1:10 من الأمصال في ألف العازلة وعادة لا يتم إضافة إلى آبار الأمصال الأخيرين من لوحة رئيسية بسبب محجوز لهذه الفراغات العازلة.
- قبل استخدام لوحة رئيسية ، على نطاق واسع أنها تهتز (1-2 ساعات) على منصة المدورة. المصل في لوحة الرئيسي هو ستابلي ما لا يقل عن 1 في الشهر (أو أكثر) في 4 درجات مئوية ، إذا تخزينها بشكل صحيح لمنع التبخر.
- على النحو المبين أدناه ، وهذا الطبق الرئيسي يوفر 10 ميكرولتر من الأمصال المخفف لإزالة التنميط مرارا من الأمصال ضد مستضدات متعددة. ويمكن أيضا لوحات رئيسية أكبر وأصغر استخدامها. ختم لوحة جيدا مع Parafilm عندما لا يتم استخدامه.
الجزء 4 : LIPS مقايسة
- وتستخدم مادة البولي بروبيلين 96 - الضحلة لوحات microtiter جيدا لاختبار الأمصال. في الخطوة الأولى ، إضافة ميكرولتر من 40 ألف إلى المخزن كل بئر من لوحة 96 - جيدا باستخدام micropipette قناة 8.
- تتخذ المقبل 10 ميكرولتر الأمصال المخفف (أي ما يعادل 1 الأمصال ميكرولتر) من لوحة رئيسية وإضافتها مباشرة إلى كل بئر من لوحة العمل باستخدام micropipette قناة 8.
- وضعت المقبل مزيج الرئيسي الذي يحتوي على استخراج RUC مستضد بحيث يتم إضافة 1 X 10 7 وحدات خفيفة (LU) في 50 ميكرولتر من العازلة ألف إلى كل بئر. ويمكن أيضا انخفاض المدخلات (اقل من 1 10 X 6) يمكن استخدامها ، ولكن النتيجة في مدى أقل ديناميكية. جعل هذا الخليط الماجستير وماصة 50 ميكرولتر من شرطة ألستر الملكية مستضد الخليط إلى كل بئر.
- احتضان لوحة على شاكر دوارة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- أثناء الحضانة ، إضافة 5 ميكرولتر من تعليق 30 ٪ من البروتين Ultralink A / G الخرز (بيرس التكنولوجيا الحيوية ، روكفورد ، ايل) في برنامج تلفزيوني في الجزء السفلي من كل بئر جديدة من 96 لوحة جيدا HTS تصفية (ميليبور ، بيدفورد ، ماجستير) .
- بعد حضانة 1 ساعة ، نقل 100 ميكرولتر تفاعل الأضداد RUC مستضد الخليط جيدا إلى 96 لوحات تحتوي على فلتر HTS البروتين A / G الخرز باستخدام micropipette قناة 8.
- احتضان لوحة 96 - جيدا على تصفية شاكر دوارة لمدة 1 ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
- غسل المقبل لوحة تصفية على مشعب فراغ. يتم غسلها جيدا كل 8 مرات مع 100 ميكرولتر من منطقة عازلة ، تليها مرتين مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. ويمكن تنفيذ هذه يدويا أو مع محطة pipetting الروبوتية.
- بعد غسل الماضي ، تحولت قبالة الفراغ. إزالة لوحة تصفية وصمة عار لتجف به كومة من مناشف ورقية أو ورقة تصفية مع التأكد من إزالة الرطوبة على الجزء العلوي والسفلي من اللوحة.
الجزء 5 : التلألؤ قياس وتحليل البيانات
انشاء :
ويستخدم LB برتولد 960 luminometer microplate سنترو لتحديد التألق في كل بئر باستخدام محقن واحد. مرة واحدة على الجهاز ، شطف مع حاقن المقطر 2 O H باستخدام محقن دورة الغسيل. مستعدة الركيزة Coelenterazine باستخدام الركيزة Renilla Promega عدة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. عادة 6 مل من مزيج 1X coelenterazine الركيزة (أي الأسهم coelenterazine 60 ميكرولتر بالاضافة الى 6 مل من 1X العازلة) مستعدة لفتيلة الجهاز وتشغيل لوحة واحدة كاملة 96 - جيدا. قبل تحليل لوحة ، وتستعد لبرتولد LB 960 luminometer microplate سنترو مع الركيزة coelenterazine 1X. فتح ملف يحتوي على برنامج الإعداد لحقن الركيزة وقراءة اللوحة. لهذه القياسات ، ويتم حقن 50 ميكرولتر من الركيزة coelenterazine ، تهتز لوحة ل2 ثانية ، تليها قراءة ثانية 5 من التألق.
- على الرغم من أن لوحة luminometer لديه القدرة على قراءة لوحة كاملة ، ويمكن أيضا قراءة جزء من لوحة يتم اختيار (ضمن القائمة للقراءة). بدء تشغيل البرنامج ، الذي يبدأ القراءة من لوحة.
- بعد تشغيل ، وإزالة لوحة تصفية microtiter على الفور لمنع تسرب في luminometer. تصدير البيانات التي تم إنشاؤها مع برنامج MikroWin إلى تنسيق Excel للتحليل.
- نوصي تقييم الأمصال من اثنان أشواط مستقلة. وبلغ متوسط ثم البيانات إلى توليد القيم عيار LU عن كل عينة. ويمكن زيادة هذه القيم يجب أن تعدل لطرح الفراغات العازلة.
- تحليل بيانات إضافية مثل تحديد يمكن حسابها من القطع المتوسط عن طريق اتخاذ زائد 3 أو 5 الانحرافات المعيارية للقيم السيطرة.
Discussion
LIPS تتطلب الحد الأدنى من التحسين مقايسة ، ونظرا لبساطته ، ويمكن عادة تكون البيانات ذات جودة عالية تم إنشاؤها باستخدام LIPS في أقل من أسبوعين عن أي مستضد معين. الخطوات الأكثر استهلاكا للوقت والاستنساخ وتوليد التعبير المناسب ناقلات البلازميد التي تحتوي على الانصهار RUC مستضد. حالما يتم إنشاء هذه البلازميدات ، يمكن المستضدات واحد أو عدة اختبار سريع مع الشفاه كما هو موضح أعلاه. وتجدر الإشارة إلى أن الشفاه هي متعددة للغاية ويمكن أيضا أن مثل هذه الأمصال يتم اختبارها في شكل أنبوب أو بدلا من ذلك على طبق من ذهب microtiter تصفية مع المعونة من محطة عمل BIOMEK الروبوتية 2 أو غسالة مع لوحة الترشيح فراغ. هذا النظام يسمح تدرجية عالية للLIPS موازية التنميط فريق من autoantigens الإنسان بروتيوم 3 أو 4 كاملة من الفيروس. فمن المحتمل أن العديد من التشكيلات المختلفة التي تم إنشاؤها بواسطة الأجسام المضادة LIPS مفيدا للتشخيص 3-9 ، اكتشاف المستضد 9 ، بعد مسار علاج 10 والرصد لقاح ولها آثار واسعة للدول محددة والمرض على الصحة العامة بشكل عام.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية للNIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HiSpeed Plasmid Midi KIt | Qiagen | 12643 | |
| 100 x 20 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | Deep well plate with lid and seal with Parafilm |
| Polypropylene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS Filter plate | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| Ultralink Immobilized Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega Corp. | E2820 | For 2000 assays |
| Centro microplate luminometer | Berthold Technologies | LB 960 |
References
- Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins. BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).
- Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection. PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).
- Burbelo, P. D. Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome. Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).
- Burbelo, P. D. Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems). Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).
- Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).
- Burbelo, P. D. A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2. Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).
- Burbelo, P. D. Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay. Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).
- Burbelo, P. D. Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies. Virol J. 6, 45-45 (2009).
- Burbelo, P. D. Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection. Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).
- Ramanathan, R. A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection. J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).
